[發明專利]一種從食醋發酵過程中提取微生物總基因組的方法

有效

• 申請號: 201310309256.6
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN103409410A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 王敏;聶志強;鄭宇;申雁冰;韓玥;駱健美;牛丹丹
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產權代理事務所(普通合伙) 11348
• 代理人: 王偉鋒

1.一種從食醋發酵過程中提取微生物總基因組的方法，其特征在于，包括如下步驟：

①食醋發酵樣品預處理：取液態或半固態樣品0.2-5g在4℃6000-8000×g離心10-30min，棄上清，于-80℃預凍后真空冷凍干燥，研磨樣品至粉末狀，待用；固態樣品置于-20℃預冷的無菌研缽中，傾入液氮，研磨樣品至粉末狀，待用。

②微生物基因組DNA的抽提：向預處理后的樣品中加入1.0mL-2.0mL?DNA提取液，置于37℃的恒溫振蕩搖床在200-400rpm振搖15-30min后，加入質量比1%-5%的SDS，充分混勻后置于65℃水浴鍋中孵育1-3h，每15min-20min顛倒幾下，向抽提液中加入1-2倍體積的PEG8000，室溫放置1-2h，10000-12000×g離心10-30min，棄上清，將沉淀溶于1-2mL?TE緩沖液,加入3-5mol/L乙酸鉀溶液,4℃放置15-60min，12000-15000×g離心10-20min，取上清，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液，酚∶氯仿∶異戊醇體積比為25∶24∶1，12000-15000×g離心10-30min。

③除雜及漂洗濃縮：吸取步驟②DNA抽提后的上清水相，加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，氯仿∶異戊醇體積比為24∶1，12000-15000×g離心5-10min，吸取上清，加醋酸銨-異丙醇混合液，-20～-80℃放置1-3h沉淀DNA，12000-15000×g離心10-20min，棄上清，取沉淀；用預冷的70%乙醇漂洗沉淀，12000-15000×g離心5-10min，棄上清，室溫放置，直至乙醇揮發完全，加入50-100μL雙蒸水溶解沉淀，得到微生物基因組總DNA。

2.如權利要求1所述的一種從食醋發酵過程中提取微生物總基因組的方法，其特征在于，步驟①中所述-80℃預凍時間為30-60min，真空冷凍干燥時間為2-5h。

3.如權利要求1所述的一種從食醋發酵過程中提取微生物總基因組的方法，其特征在于，步驟②所述DNA提取液組成包括：50-100mmol/L?Tris-HCl，1-1.5mol/L?NaCl，50-100mmol/LEDTA，50-100mmol/L磷酸鈉緩沖液，0.5%-2%w/v?CTAB，1%-3%w/v?PVPP，pH8.0，溶劑為水。

4.如權利要求1所述的一種從食醋發酵過程中提取微生物總基因組的方法，其特征在于，步驟②所述乙酸鉀溶液的添加量為10%-20%v/v。

5.如權利要求1所述的一種從食醋發酵過程中提取微生物總基因組的方法，其特征在于，步驟③所述醋酸銨-異丙醇混合液與上清液體積比為1∶1-2，醋酸銨溶液:異丙醇體積比為1∶1-5。

6.如權利要求1所述的一種從食醋發酵過程中提取微生物總基因組的方法，其特征在于，步驟③所述醋酸銨溶液的濃度為6-8mol/L，pH為7-7.5。

7.如權利要求5所述的一種從食醋發酵過程中提取微生物總基因組的方法，其特征在于，所述醋酸銨-異丙醇混合液中醋酸銨溶液∶異丙醇體積比為1∶3。

8.權利要求1-7任一所述的提取微生物總基因組的方法用于食醋發酵過程中混合微生物的宏基因組測序的用途。