[發明專利]基于礦物油飽和PDMS材料的數字PCR芯片的制作方法

有效

• 申請號: 201310306080.9
• 申請日: 2013-07-19
• 公開（公告）號: CN103343092A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 景奉香;李剛;高雁;景曉剛;賈春平;張冀申;金慶輝;趙建龍
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海微系統與信息技術研究所
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12Q1/68
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 潘振甦

技術領域

本發明涉及一種基于礦物油飽和PDMS材料的數字PCR（聚合酶鏈反應）芯片的制作方法，制作的芯片。用于低豐度核酸檢測，可以應用于生物學、醫學及環境科學等領域。

背景技術

熒光定量PCR（Fluorescence?Quantitative?Polymerase?Chain?Reaction，FQ-PCR，qPCR）已發展成為分子生物學領域的一項關鍵的常規技術，極大地推動了生命科學各個領域的發展。但是，PCR擴增過程中影響其擴增效率的因素很多，很難保證實際樣品與標準樣品以及不同樣品之間的擴增效率相同，由此導致其定量分析所依賴的基礎—循環閾值(Cycling?Threshold?Value，Ct)不是恒定不變的。因此qPCR的定量只是“相對定量”，其準確度和重現性依然不能夠滿足分子生物學定量分析的要求。另外，由于PCR擴增產物對酶催化反應的抑制作用，目前基于PCR技術的基因變異檢測方法對體細胞中低豐度的基因變異常常無能為力的。

數字PCR（Digital?PCR，dPCR）是一種基于單分子PCR方法來進行計數的核酸定量方法，是一種絕對定量的方法。主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數少于或者等于1個。這樣經過PCR循環之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。與傳統定量PCR不同，數字PCR通過直接計數的方法，可以實現起始DNA模板的絕對定量。

另外，數字PCR還是一種可以在大量的野生型DNA背景中鑒定出微量突變體的方法。由于數字PCR技術可以將模板DNA分子事先分隔開來單獨進行擴增，這就避免了高豐度等位基因核酸對變異核酸的擴增抑制，因此提高了微量變異核酸的檢出效率。乳滴數字PCR技術能夠檢測低至0.001%的突變片段，而測序及常規實時熒光定量PCR法對少于1%的突變是無能為力的，因此突變檢測靈敏度可提高1000倍。

傳統的數字PCR技術的一般操作流程比較復雜，通常是首先通過手工逐級稀釋并分配樣品至微孔板中，然后將微孔板置于熱循環儀上進行PCR反應，反應結束后通過儀器讀取每個微孔中的熒光信號，最終根據泊松分布原理以及陽性微滴的比例，結合分析軟件可計算給出待檢靶分子的濃度或拷貝數。這種方式操作繁瑣、通量小、效率低，而且較少的液滴分解數目也限制了其精度和可測的動態范圍，應用方面有很大的局限。近年來，微流控技術的發展為數字PCR技術的發展注入了新的活力。由于微流控技術在微流體操控方面的優勢，使得我們可以將樣品分解為納升甚至皮升級，獲得更多的樣品分解數目，從而大大提高數字PCR技術的檢測靈敏度、可信度和動態范圍度。另外，微流控技術自動化、易集成、通量高的優勢，也可極大地提高數字PCR技術的檢測效率。

借助微流控技術在微流體操控方面的優勢，最近國際上已有多個研究小組和公司開發了基于微流控技術的數字PCR系統。比較典型的包括Fluidigm公司推出的基于微室型的BioMark^TM系統和Bio-Rad公司推出的基于液滴型的QX100TM系統。相對于傳統的數字PCR技術，這兩個系統在操作的自動化、檢測的靈敏度、準確度以及可測濃度動態范圍都有了極大的提高，但是在實際應用中仍存在一定缺陷，主要因為這兩個系統均需要額外的控制部件來實現樣品的分解，導致系統的復雜度較高，從而增加了系統的成本，限制了其應用。

PDMS（polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷）是一種具有彈性的高分子聚合物，因其成本低，使用簡單，而且具有良好的光學特性，良好的絕緣性，良好的化學惰性以及良好的透氣性等特點，成為一種廣泛應用于微流控等領域的聚合物材料。

在數字PCR領域，人們多采用PDMS制作乳滴生成芯片，直接在PDMS芯片上進行數字PCR擴增及分析的例子較少，主要原因是由于其一來透氣性強，二來由于其具有良好的親油性，PCR熱循環過程中對油性分子的具有超強的吸收能力，因此無法實現擴增。

近幾年也有少數在PDMS芯片上直接進行數字PCR擴增的例子，他們避免油、液揮發的方式主要為：1：PDMS芯片乳滴點陣上放貼敷玻璃片；2：芯片內噴涂對聚二甲苯。

上面所述的第一種方式，根本無法阻擋PDMS芯片材料本身對礦物油的吸收，而PDMS本身對礦物油的吸收能力是很強的；所述的第二種方式工藝條件比較復雜，一般實驗室無法滿足該條件。