[發明專利]基于礦物油飽和PDMS材料的數字PCR芯片的制作方法

有效

• 申請號: 201310306080.9
• 申請日: 2013-07-19
• 公開（公告）號: CN103343092A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 景奉香;李剛;高雁;景曉剛;賈春平;張冀申;金慶輝;趙建龍
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海微系統與信息技術研究所
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12Q1/68
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 潘振甦

1.基于礦物油飽和PDMS材料的數字PCR芯片的制作方法，其特征在于包括芯片的制備、乳滴的生成以及PCR擴增，

（1）芯片的制備包括模具的設計和制備，先制作微管道和進樣槽，然后是PDMS材料的制備，PDMS材料制備是先用將一定量的礦物油混合的PDMS單體中，在PDMS芯片交聯固化過程中，礦物油自動的填充其中的空隙，最大限度的抑制制作好的PDMS芯片對數字PCR體系中油相的吞噬，維持PCR反應過程中乳滴及PCR反應的穩定性；每1ml?PDMS中含100-400μl礦物油，所述的礦物油為液體石蠟；

（2）乳滴的生成

微流控芯片乳滴的形成通過“十”字型或“T”字型兩種芯片結構形式，通過調整油相及水相進樣管道的尺寸、長度的不同，對所形成乳滴的尺寸或濃度進行調控；乳滴在同一芯片上制作、收集，然后在同一芯片上進行PCR擴增；

（3）PCR擴增

將進樣完畢的芯片平放在具有原位PCR功能的PCR儀上進行擴增，擴增的變性溫度與復性、擴增溫度均與乳滴中所包裹PCR混合液的條件相同，但適當延長保溫時間。

2.按權利要求1所述的方法，其特征在于：

①所述的芯片區包括乳滴的生成結構和乳滴收集結構兩部分；

②所述芯片材料為載玻片或蓋玻片。

3.按權利要求1所述的方法，其特征在于微管道和進樣槽制作是首先利用CAD軟件設計圖案打印掩模版，然后利用光刻膠SU8?2050在硅片上制作微管道和進樣槽結構，在負壓進樣過程中起到支撐作用，防止乳滴收集區域塌陷堵塞。

4.按權利要求1所述的方法，其特征在于所述PDMS芯片的制作是：

①首先將PDMS預聚體按每200g加10ml石蠟油的比例將PDMS與石蠟油充分混勻，再將混勻后的質量比10：1液相和固化劑混合，抽真空除氣，澆注在模具上；

②在載玻片上薄涂一層為混過石蠟油的PDMS，靜置1h，放于65℃熱板上預固化30分鐘；

③將澆注于模具上的PDMS剝離，打孔，將有管道面與涂層后的玻璃涂層面貼合在一起，并在進樣槽上方加蓋一蓋玻片，以防負壓進樣槽下陷；

④最后將貼合好的PDMS放入85℃的熱板上加熱10min，使其鍵合。

5.按權利要求1所述的方法，其特征在于通過十字型方式形成乳滴是：

①在樣品進樣口注入PCR預混液，油進樣口注入含乳化劑的含3%AbilEM90的液體石蠟；

②將注射器置于泵上，注射端連接輸液皮條，將皮條插入抽吸孔，尾端接負壓泵；

③利用負壓泵的抽吸作用，PCR預混液及石蠟油由進樣口朝出樣口方向流動，在芯片十字交叉結構處，在兩側石蠟油的夾流作用下切割形成納升級的乳滴；

④在微壩的作用下，乳滴在乳滴收集腔中聚集濃縮，填滿腔體，此時用PDMS封閉進樣口及出樣口；

所述的PCR預混液：20ul預混液中包含10ul?Roche?480?Probe?Premix，各250nM?EGFR基因19外顯子上下游引物，200nM?TaqMan探針，10ng基因組DNA。

6.按權利要求5所述的方法，其特征在于：

a)步驟③切割形成的納升級乳滴直徑為50μm；

b)步驟④所述的微壩壩間尺寸小于20μm；

c)步驟②所述的負壓泵為COSMO，雙型號12000。

7.按權利要求1所述的方法，其特征在于PCR原位擴增時循環程序為95℃10min預變性，95℃10s，58℃40s循環40次，最后4℃保溫。

8.按權利要求1所述的方法，其特征在于乳滴生成時：

①進油管道及進樣管道高度20-120μm，寬度20-150μm均能形成良好的乳滴；

②切割形成的乳滴直徑為皮升級或納升級，乳滴直徑在150μm以下均能保持穩定。