[發(fā)明專利]基于礦物油飽和PDMS材料的數(shù)字PCR芯片的制作方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310306080.9
• 申請(qǐng)日: 2013-07-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103343092A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 景奉香;李剛;高雁;景曉剛;賈春平;張冀申;金慶輝;趙建龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12M1/34
• 分類號(hào): C12M1/34;C12Q1/68
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 潘振甦

1.基于礦物油飽和PDMS材料的數(shù)字PCR芯片的制作方法，其特征在于包括芯片的制備、乳滴的生成以及PCR擴(kuò)增，

（1）芯片的制備包括模具的設(shè)計(jì)和制備，先制作微管道和進(jìn)樣槽，然后是PDMS材料的制備，PDMS材料制備是先用將一定量的礦物油混合的PDMS單體中，在PDMS芯片交聯(lián)固化過(guò)程中，礦物油自動(dòng)的填充其中的空隙，最大限度的抑制制作好的PDMS芯片對(duì)數(shù)字PCR體系中油相的吞噬，維持PCR反應(yīng)過(guò)程中乳滴及PCR反應(yīng)的穩(wěn)定性；每1ml?PDMS中含100-400μl礦物油，所述的礦物油為液體石蠟；

（2）乳滴的生成

微流控芯片乳滴的形成通過(guò)“十”字型或“T”字型兩種芯片結(jié)構(gòu)形式，通過(guò)調(diào)整油相及水相進(jìn)樣管道的尺寸、長(zhǎng)度的不同，對(duì)所形成乳滴的尺寸或濃度進(jìn)行調(diào)控；乳滴在同一芯片上制作、收集，然后在同一芯片上進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

（3）PCR擴(kuò)增

將進(jìn)樣完畢的芯片平放在具有原位PCR功能的PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的變性溫度與復(fù)性、擴(kuò)增溫度均與乳滴中所包裹PCR混合液的條件相同，但適當(dāng)延長(zhǎng)保溫時(shí)間。

2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

①所述的芯片區(qū)包括乳滴的生成結(jié)構(gòu)和乳滴收集結(jié)構(gòu)兩部分；

②所述芯片材料為載玻片或蓋玻片。

3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于微管道和進(jìn)樣槽制作是首先利用CAD軟件設(shè)計(jì)圖案打印掩模版，然后利用光刻膠SU8?2050在硅片上制作微管道和進(jìn)樣槽結(jié)構(gòu)，在負(fù)壓進(jìn)樣過(guò)程中起到支撐作用，防止乳滴收集區(qū)域塌陷堵塞。

4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述PDMS芯片的制作是：

①首先將PDMS預(yù)聚體按每200g加10ml石蠟油的比例將PDMS與石蠟油充分混勻，再將混勻后的質(zhì)量比10：1液相和固化劑混合，抽真空除氣，澆注在模具上；

②在載玻片上薄涂一層為混過(guò)石蠟油的PDMS，靜置1h，放于65℃熱板上預(yù)固化30分鐘；

③將澆注于模具上的PDMS剝離，打孔，將有管道面與涂層后的玻璃涂層面貼合在一起，并在進(jìn)樣槽上方加蓋一蓋玻片，以防負(fù)壓進(jìn)樣槽下陷；

④最后將貼合好的PDMS放入85℃的熱板上加熱10min，使其鍵合。

5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于通過(guò)十字型方式形成乳滴是：

①在樣品進(jìn)樣口注入PCR預(yù)混液，油進(jìn)樣口注入含乳化劑的含3%AbilEM90的液體石蠟；

②將注射器置于泵上，注射端連接輸液皮條，將皮條插入抽吸孔，尾端接負(fù)壓泵；

③利用負(fù)壓泵的抽吸作用，PCR預(yù)混液及石蠟油由進(jìn)樣口朝出樣口方向流動(dòng)，在芯片十字交叉結(jié)構(gòu)處，在兩側(cè)石蠟油的夾流作用下切割形成納升級(jí)的乳滴；

④在微壩的作用下，乳滴在乳滴收集腔中聚集濃縮，填滿腔體，此時(shí)用PDMS封閉進(jìn)樣口及出樣口；

所述的PCR預(yù)混液：20ul預(yù)混液中包含10ul?Roche?480?Probe?Premix，各250nM?EGFR基因19外顯子上下游引物，200nM?TaqMan探針，10ng基因組DNA。

6.按權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：

a)步驟③切割形成的納升級(jí)乳滴直徑為50μm；

b)步驟④所述的微壩壩間尺寸小于20μm；

c)步驟②所述的負(fù)壓泵為COSMO，雙型號(hào)12000。

7.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于PCR原位擴(kuò)增時(shí)循環(huán)程序?yàn)?5℃10min預(yù)變性，95℃10s，58℃40s循環(huán)40次，最后4℃保溫。

8.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于乳滴生成時(shí)：

①進(jìn)油管道及進(jìn)樣管道高度20-120μm，寬度20-150μm均能形成良好的乳滴；

②切割形成的乳滴直徑為皮升級(jí)或納升級(jí)，乳滴直徑在150μm以下均能保持穩(wěn)定。