[發明專利]一種用于系統性紅斑狼瘡的早期診斷的檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201310305641.3
• 申請日: 2013-07-19
• 公開（公告）號: CN104293901A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 劉驍
• 申請（專利權）人: 金弗康生物科技(上海)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種用于系統性紅斑狼瘡的早期診斷的檢測試劑盒。

背景技術

系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種自身免疫介導的，以免疫性炎癥為突出表現的彌漫性結締組織病，累及全身多系統、多器官、臨床表現復雜、病程遷延反復的自身免疫性疾病。本病多發于生育年齡女性，我國約有一百萬患者，并有逐年增加趨勢，平均患病率更是高居全球第二位。

然而，系統性紅斑狼瘡的臨床誤診率相當高，這主要因為系統性紅斑狼瘡是由于遺傳、感染、性激素及環境等多因素相互作用引起機體免疫紊亂所致，病因則迄今未明。雖然美國風濕病協會（ARA）在1997年頒布了11項分類標準，這也是目前臨床診斷最常用的手段；免疫膠體金檢測抗雙鏈DNA法在一定程度上也能有效的幫助確診SLE。但這類診斷方法多適用于典型或活動期的系統性紅斑狼瘡的診斷，對早期、不典型或非活動期的患者則不適用，因為早期患者臨床表現通常不典型，癥狀也無特異性，尤其是單系統受累患者更加難以診斷。這也是造成誤診和漏診的一個主要原因。

誤診除了會給患者造成健康和經濟上的雙重負擔，最主要的是會延誤病情，增加死亡的危險。據統計，在SLE患者中，首發癥狀以關節疼痛維多，約占40%，而近1/4的誤診為類風濕性關節炎，臨床上平均35%的患者會并發腫瘤。然而，早期就接受正規系統治療的患者10年以上的存活率卻可達75%。由此可見，早期診斷，早期治療對SLE患者的康復尤為重要。

建立一種簡單快捷準確的早期檢測方法，有助于幫組醫生及時篩查出系統性紅斑狼瘡，避免因為誤診導致病人的病情惡化。?

SNP(single?nucleotide?polymorphism)，單核苷酸多態性位點，也被稱為第三代遺傳標記。在位于基因5’端非翻譯區和基因編碼區（外顯子）內的SNP，往往會引起蛋白質含量變化及功能異常，進而導致生物體性狀變異，在遺傳研究和疾病分子機制研究中具有重要意義，也越來越多的被作為各種疾病的分子診斷標記。

近年來，研究人員通過比較SLE患者和健康人群的基因組，發現并確認了CR2基因功能異常與SLE的發生機制顯著相關。含有特異CR2突變位點的人群發生SLE的幾率更是顯著升高160%。

CR2基因是Complement?receptor?2的簡寫，中文名稱前列腺干細胞抗原。該基因位于人第1號常染色體第32帶區。由19個外顯子組成,編碼一個B細胞表面的糖蛋白，是人體自身免疫系統的重要調節因子。大量的研究證明，SLE病者體內都伴隨著CR2蛋白水平的顯著下降。2007年，Wu?et.?al.?首次在來自258個高加索家庭和142個中國家庭的1416名SLE患者中發現了位于CR2基因5’UTR上的rs3813946突變可改變CR2基因的轉錄水平,而位于第10外顯子上的rs17615和rs1048971則通過改變蛋白序列影響CR2的特異結合功能。這個發現分別在2009和2012年在2084例歐洲和美洲的SLE患者中得到驗證。CR2基因上的rs17615,rs1048971和rs3813946三個SNP位點可以作為SLE的早期檢測指標。

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發明內容

CR2基因上的rs17615,rs1048971和rs3813946三個SNP位點的組合可以用來作為SLE早期診斷的輔助手段，降低誤診率。

本發明提供一種用于檢測CR2基因上的rs17615,rs1048971和rs3813946三個SNP突變位點的檢測試劑盒，包括：

（1）????檢測CR2基因上rs17615和rs1048971突變位點的特異性引物；

（2）????檢測CR2基因上rs3813946突變位點的特異性引物；

（3）????PCR擴增反應試劑（包括Taq酶，dNTP混合液，反應緩沖液，無菌去離子水）；

（4）????DNA測序反應試劑（包括BigDye?mix,EDTA溶液，100%乙醇，70%乙醇，HIDI溶液，無菌去離子水）;

本發明試劑盒的組分和含量包括：

（1）????PCR反應體系：10mM的dNTP混合液2μl；5U/μl的Taq?DNA聚合酶1μl；Taq?Buffer?10μl,特異引物各1μl；25mM的MgCl_2?10μl；無菌去離子水73μl；

（2）????測序反應體系：25%的BigDye?mix?1μl；DNA測序引物1μl；125mM的EDTA溶液1μl；100%乙醇溶液15μl；70%乙醇溶液30μl；HIDI溶液10μl;無菌去離子水10μl；