[發明專利]一種預防血吸蟲感染長效青蒿琥酯藥物及其制備方法

有效

• 申請號: 201310304323.5
• 申請日: 2013-07-18
• 公開（公告）號: CN103405779A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 余傳信;金一;宋麗君;王玠;殷旭仁;沈雙
• 申請（專利權）人: 江蘇省血吸蟲病防治研究所
• 主分類號: A61K47/48
• 分類號: A61K47/48;A61K31/357;A61P33/12;C12N15/62;C12N15/70;C07K19/00
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 曾少麗

1.一種預防血吸蟲感染長效青蒿琥酯藥物，包括青蒿琥酯AS，其特征在于，還包括與青蒿琥酯相偶聯的載體蛋白，所述載體蛋白是對人與動物無毒副作用、無或低免疫原性的蛋白分子。

2.根據權利要求1所述的一種預防血吸蟲感染長效青蒿琥酯藥物，其特征在于，所述載體蛋白由GST和NSP兩部分組成，所述GST是人工改造的低免疫原性的日本血吸蟲谷胱甘肽轉移酶分子，所述NSP是人工設計的低免疫原性非結構蛋白。

3.根據權利要求2所述的一種預防血吸蟲感染長效青蒿琥酯藥物，其特征在于，所述GST蛋白氨基酸序列與序列SEQIDNO：1保持有至少90%的同源性，所述GST蛋白核苷酸序列編碼為SEQIDNO：2。

4.根據權利要求2所述的一種預防血吸蟲感染長效青蒿琥酯藥物，其特征在于，所述NSP蛋白由丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸組成，所述NSP蛋白氨基酸序列與序列SEQIDNO：3保持有至少90%的同源性，所述NSP蛋白核苷酸序列編碼為SEQIDNO：4。

5.根據權利要求1所述的一種預防血吸蟲感染長效青蒿琥酯藥物，其特征在于，所述載體蛋白氨基酸序列與序列SEQIDNO：5保持有至少90%的同源性，所述載體蛋白核苷酸序列編碼為SEQIDNO：6。

6.一種如權利要求1所述的預防血吸蟲感染長效青蒿琥酯藥物的制備方法，其特征在于，步驟如下：

（a）GST-NSP蛋白的編碼基因和重組表達質粒的構建：首先依據設計的編碼NSP基因合成其DNA序列,并在其5′端和3′端分別引入酶切位點BamH1和Sal1，通過此兩個限制性酶切位點將編碼NSP蛋白的基因片段插入到表達質粒GST基因的下游，使編碼NSP蛋白基因與表達載體中BamH1位點上游編碼GST蛋白的基因序列發生框內融合，形成GST蛋白與NSP蛋白融合表達的重組質粒系統。

（b）GST-NSP蛋白的表達：將重組質粒轉化革蘭氏陰性宿主菌,在含卡那霉素的LB固體培養基上篩選重組質粒的轉化子工程菌，將含重組質粒的工程菌接種到LB液體培養基中進行培養，經IPTG的誘導獲得表達產物GST-NSP蛋白。

（c）GST-NSP蛋白的分離純化：選擇谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B柱，對表達產物中的GST-NSP蛋白進行親和純化。

（d）青蒿琥酯與GST-NSP蛋白的偶聯：將青蒿琥酯用DMSO溶解后，用氯甲酸異丁酯活化青蒿琥酯結構中的游離羧基，再將其與GST-NSP蛋白游離氨基結合，形成(AS)_n-GST-NSP偶聯物，用透析法去除未結合的青蒿琥酯分子。

7.根據權利要求6所述的預防血吸蟲感染長效青蒿琥酯藥物的制備方法，其特征在于，所述步驟（a）中表達質粒是pET41a(+)，所述pET41a(+)含有啟動子。

8.根據權利要求7所述的預防血吸蟲感染長效青蒿琥酯藥物的制備方法，其特征在于，所述啟動子是T7Promoter。

9.根據權利要求7所述的預防血吸蟲感染長效青蒿琥酯藥物的制備方法，其特征在于，所述步驟（b）中革蘭氏陰性宿主菌是大腸桿菌BL21。