[發明專利]一種制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法

有效

• 申請號: 201310303699.4
• 申請日: 2013-07-18
• 公開（公告）號: CN103352062A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發明（設計）人: 劉桂艷;李春;王棟;汪竹;高自強;劉冬羽
• 申請（專利權）人: 北京理工大學
• 主分類號: C12P19/56
• 分類號: C12P19/56;C12N9/24;C12R1/80
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技術領域

本發明涉及一種制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法,屬于食品添加劑（甜味劑）領域。?

背景技術

甘草是豆科甘草屬灌木狀多年生草本植物，是重要的食品添加劑和傳統中藥。甘草酸（GL）屬于五環三萜類化合物，在甘草中含量最高（3-11%），是甘草中的主要活性成分之一，但是過多攝入甘草酸會導致人體內鈉排出減少而鉀排出增加，產生一定的副作用。GL水解掉一個葡萄糖醛酸基后生成產物——單葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG），結構見圖1。GAMG甜度是甘草酸的5倍，是蔗糖的近1000倍，是一種高甜度、低熱量的新型甜味劑。動物實驗表明GAMG的LD50為5000mg/kg，遠遠大于甘草酸的LD50805mg/kg，說明GAMG比GL更安全。GAMG極性介于GL和甘草次酸（GA）之間為中等極性，在體內同時具有良好的溶解度和跨膜轉運的能力，比GL和GA具有更好的生物利用度。作為食品添加劑GAMG比GL具有更多的優點。因此生產和開發GAMG具有很重要的應用價值和現實意義。?

由于甘草酸分子中的兩個糖苷鍵的鍵能是相似的，化學水解法對這兩個糖苷鍵的選擇性很低，不能將甘草酸定向水解生成GAMG。利用生物轉化生產GAMG，可以克服化學方法的低選擇性、高耗能、高污染的缺點。生物轉化是利用微生物、動植物的培養體系或其產生的酶制劑對外源化合物進行結構修飾的生物化學反應過程，其本質是利用生物體系本身所產生的酶對外源化合物進行酶催化反應，亦稱酶促反應。該技術自20世紀50年代興起，近10年迅速發展起來。酶催化的優點：高度的立體選擇性、催化效率高和反應條件溫和等，可以完成一些化學方法難以實現的反應。目前生物轉化技術已廣泛應用到食品、藥品以及化工產品等領域中。?

目前已發現的能夠轉化甘草酸為GAMG的β-葡萄糖醛酸苷酶存在于腸道細菌、動物組織和土壤中，但是來源于腸道細菌和動物組織的酶普遍存在化學鍵選擇性偏低的缺點，不僅產生GAMG，還產生大量的副產物甘草次酸（GA），見圖1。來源于動物組織的酶成本高，制備較麻煩。發明人所在的李春教授課題組從新疆主要甘草產區中的土樣中分離篩選出來的菌株——產紫青霉Penicillium?purpurogenumLi-3，其誘導產生的β-葡萄糖醛酸苷酶能將商品甘草酸單銨鹽水解生成GAMG，定向性好，甘草酸轉化率可達88.45%(馮世江、李春等,高校化學工程學報,2007,21：977-982)。利用該菌定向生物合成GAMG的方法已申請了國家專利（CN101603067），菌種PenicilliumpurpurogenumLi-3已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101，保藏號：CGMCC?No5446，保藏日期2011年11月04日。?

然而，甘草酸單銨鹽是由甘草經多步分離純化制得，原料價格限制了GAMG生產成本的降低。如果直接以甘草總提取物為碳源可以減少很多提取分離步驟，大大降低生產成本,而且,文獻報道，甘草屬植物中除甘草酸外，還有4種含GAMG骨架結構的化合物，只是糖連接的位置不同，見圖2。若以甘草為原料通過適當的生物轉化過程，可能使這4種化合物也轉化生成GAMG，從而提高GAMG產量。但是,盡管甘草酸在甘草中含量最高,以甘草總提取物或甘草三萜粗品為碳源直接利用菌體進行生物轉化生產GAMG卻不能實現。?

本發明專利的方法不僅能夠使以甘草總提物或甘草三萜粗品為碳源生物轉化生成GAMG得以實現，而且在制備β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制劑過程中，以甘草酸單銨鹽為碳源并添加促進劑，比以甘草酸單氨鹽為碳源不添加促進劑產生的β-葡萄糖醛酸苷酶酶活提高，GAMG產率提高，時間提前（見實施例2）。產率提高一直是工業化生產追求的目標，時間提前可以節省很多能源，降低成本。該工藝研究可為未來工業化生產GAMG提供有力的技術支持。?

發明內容

本發明提供一種以甘草酸或甘草酸鹽為碳源，添加一定量的促進劑（甘草總提取物、或甘草總多糖、或甘草總黃酮），促進菌株Penicillium?purpurogenum?Li-3誘導產生β-葡萄糖醛酸苷酶，獲得β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制劑；以甘草總提取物或甘草總三萜為碳源，用該粗酶制劑生物轉化甘草總提取物或甘草總三萜中的甘草酸及其類似物，生成單葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法。本發明是通過以下技術方案實現的。?

第一項.β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制劑的制備，包括以下步驟：?