[發(fā)明專利]一種制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310303699.4
• 申請日: 2013-07-18
• 公開（公告）號: CN103352062A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉桂艷;李春;王棟;汪竹;高自強;劉冬羽
• 申請（專利權(quán)）人: 北京理工大學(xué)
• 主分類號: C12P19/56
• 分類號: C12P19/56;C12N9/24;C12R1/80
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1.一種制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于包含以下步驟：

步驟1、配制轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系，其中底物為甘草總提取物和/或甘草總?cè)疲?/p>

步驟2、向轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中加入β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制劑，轉(zhuǎn)化甘草總提取物和/或甘草總?cè)浦械母什菟峒捌漕愃莆锷蒅AMG，至產(chǎn)物濃度基本恒定；

步驟3、將步驟2中所得的轉(zhuǎn)化發(fā)酵液，經(jīng)過分離純化得到產(chǎn)品GAMG；

其中步驟2中β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制劑的制備方法為：

步驟（1）、先將能誘導(dǎo)產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸苷酶的菌種Penicillium?purpurogenum?Li-3接入到斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后得斜面種子，其中Penicillium?purpurogenum?Li-3的保藏號為CGMCCNo.5446；

步驟（2）、將步驟（1）所得的斜面種子接入種子培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后得到種子液；

步驟（3）、將步驟（2）所得的種子液接入到含有甘草酸或甘草酸鹽的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，其中產(chǎn)酶培養(yǎng)基中含有外源促進劑，促進Penicillium?purpurogenum?Li-3誘導(dǎo)產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸苷酶，其中外源促進劑為甘草總提取物、甘草總黃酮和/或甘草總多糖；

步驟（4）、從步驟（3）中獲得β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制劑，包括以下一種或幾種：(a)含有已經(jīng)產(chǎn)酶菌體的發(fā)酵液組分、（b）已經(jīng)產(chǎn)酶的菌體發(fā)酵液離心后獲得的全細胞菌體、（c）已經(jīng)產(chǎn)酶的菌體破碎細胞后制得的粗酶液、（d）已經(jīng)產(chǎn)酶的菌體冷凍干燥后制得的凍干粉、（e）含有固體培養(yǎng)和/或半固體培養(yǎng)所產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸苷酶的組分。

2.如權(quán)利要求1中所述的一種生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于：步驟1中的轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中轉(zhuǎn)化底物甘草總提取物和/或甘草總?cè)拼制窛舛葹?.01～100g/L，緩沖液pH2～10。

3.如權(quán)利要求1中所述的一種生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于：步驟2中轉(zhuǎn)化為在搖瓶或發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)過程中控制搖床轉(zhuǎn)速為100～400r/min，溫度15～65℃，pH為2.0～10.0，培養(yǎng)時間12～120小時，發(fā)酵罐發(fā)酵過程中控制轉(zhuǎn)速為100～400r/min，發(fā)酵溫度15～65℃，pH為2.0～10.0，發(fā)酵時間24～240小時。

4.如權(quán)利要求1中所述的一種生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于：步驟2中的步驟（3）產(chǎn)酶培養(yǎng)基誘導(dǎo)劑為甘草酸或甘草酸鹽，外源促進劑為從甘草中提出的甘草總提取物、甘草總黃酮和/或甘草總多糖，產(chǎn)酶培養(yǎng)基濃度（g/L）為：甘草酸或其鹽0.1～20，外源促進劑0.1～20，其它培養(yǎng)基為NH₄NO₃0.01～10，KH₂PO₄0.01～5，KCl0.01～3，MgSO₄·7H₂O0.01～3，F(xiàn)eSO₄·7H₂O0.0001～1，控制pH2.0～10.0，溫度115～125℃，15～30min滅菌后，冷卻至室溫。

5.步驟3中轉(zhuǎn)化結(jié)束后得到含GAMG的發(fā)酵液，采用酸沉、溶劑萃取，大孔吸附樹脂、硅膠、聚酰胺、C₁₈、葡聚糖凝膠方法中的一種或幾種方法聯(lián)合使用分離純化得到GAMG。

6.一種以甘草總提取物或甘草總?cè)茷榈孜锷镛D(zhuǎn)化生成單葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，具體步驟如下：

步驟1、將保藏號為CGMCCNo.5446的菌株P(guān)enicillium?purpurogenum?Li-3接入到斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后得斜面種子；

斜面培養(yǎng)基濃度（g/L）為：葡萄糖0.01～10，NH₄NO₃0.01～10，KH₂PO₄0.01～5，KCl0.01～3，MgSO₄·7H₂O0.01～3，F(xiàn)eSO₄·7H₂O0.0001～1，瓊脂0.01～30，控制pH2.0～10.0、溫度115～125℃，15～30min滅菌后，冷卻至室溫；

步驟2、將步驟1所得的斜面種子接入種子培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后得到種子液；

種子培養(yǎng)基濃度（g/L）為：葡萄糖0.01～10，NH₄NO₃0.01～10，KH₂PO₄0.01～5，KCl0.01～3，MgSO₄·7H₂O0.01～3，F(xiàn)eSO₄·7H₂O0.0001～1，控制pH2.0～10.0，溫度115～125℃，15～30min滅菌后，冷卻至室溫；

種子液為在搖瓶或發(fā)酵罐中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速100～400r/min，溫度15～50℃，培養(yǎng)時間12～120小時，發(fā)酵罐發(fā)酵過程中控制轉(zhuǎn)速為100～400r/min，通氣比為0.1～10vvm，發(fā)酵溫度15～65℃，溶氧為10～100％，pH為2.0～10.0，發(fā)酵時間12～120小時，再將活化的種子培養(yǎng)液按照1～20%（v/v）的接種量，接入種子培養(yǎng)基中進行二次活化，培養(yǎng)時間24小時，得二次活化種子液；

步驟3、將步驟2二次活化種子液按照1～30%（v/v）的接種量接入到含有甘草酸或甘草酸鹽的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入外源促進劑，至微生物被誘導(dǎo)產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸苷酶，其中誘導(dǎo)劑為甘草酸或甘草酸鹽，促進劑為甘草總提物、甘草總多糖和/或甘草總黃酮；

產(chǎn)酶培養(yǎng)基濃度（g/L）為：甘草酸或其鹽0.1～20，外源促進劑0.1～20，其它培養(yǎng)基為NH₄NO₃0.01～10，KH₂PO₄0.01～5，KCl0.01～3，MgSO₄·7H₂O0.01～3，F(xiàn)eSO₄·7H₂O0.0001～1，控制pH2.0～10.0，溫度115～125℃，15～30min滅菌后，冷卻至室溫；

步驟4、將步驟3中產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸苷酶的菌體的發(fā)酵液制備成β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制劑,β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制劑包括以下一種或幾種：(a)含有已經(jīng)產(chǎn)酶菌體的發(fā)酵液的組分、（b）已經(jīng)產(chǎn)酶的菌體發(fā)酵液離心后獲得的全細胞菌體、（c）已經(jīng)產(chǎn)酶的菌體破碎細胞后制得的粗酶液、（d）已經(jīng)產(chǎn)酶的菌體冷凍干燥后制得的凍干粉、（e）含有固體培養(yǎng)和/或半固體培養(yǎng)所產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸苷酶的組分；

步驟5、以甘草總提取物或甘草總?cè)谱鳛檗D(zhuǎn)化底物，向轉(zhuǎn)化底物反應(yīng)體系中加入步驟4中制備的β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制劑，轉(zhuǎn)化甘草總提取物或甘草總?cè)浦械母什菟峒捌漕愃莆锷蓡纹咸烟侨┧峄什荽嗡幔罣AMG濃度基本恒定，轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中轉(zhuǎn)化底物甘草總提取物和/或甘草總?cè)拼制窛舛葹?.01～100g/L,轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系pH2～10；將轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系放在搖瓶或發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)過程中控制搖床轉(zhuǎn)速為100～400r/min，溫度15～65℃，pH為2.0～10.0，培養(yǎng)時間12～120小時，發(fā)酵罐發(fā)酵過程中控制轉(zhuǎn)速為100～400r/min，發(fā)酵溫度15～65℃，pH為2.0～10.0，發(fā)酵時間24～240小時；

步驟6、轉(zhuǎn)化結(jié)束后得到含GAMG的發(fā)酵液，采用酸沉、溶劑萃取、大孔吸附樹脂色譜、硅膠色譜、聚酰胺色譜、C₁₈制備液相色譜、葡聚糖凝膠和/或離子交換色譜方法中的一種或幾種方法聯(lián)合使用分離純化得到GAMG；

其中甘草總提取物為市購產(chǎn)品或自制產(chǎn)品，其中自制產(chǎn)品的制備方法為：將含有甘草酸、甘草黃酮和甘草多糖的甘草屬植物，包括根、根莖、莖、花和/或果實，采用溫浸、滲漉、煎煮、回流、連續(xù)回流、超聲、微波或超臨界流體提取法中的一種或幾種提取；所用溶劑為以下溶劑中的任一種：A.水、B.甲醇與水的混合物、C.乙醇與水的混合物、D.丙酮與水的混合物、E.堿性水混合物、F.堿性甲醇混合物、G.堿性乙醇混合物；料液比w/v（g/ml）為1:5～1:15；提取次數(shù)1～3次，提取時間每次0.5～1.5小時，將每次提取液合并；提取液減壓濃縮后得到甘草總提取物濃縮液,或經(jīng)過干燥后制得甘草總提取物粉末；

其中促進劑甘草總黃酮和甘草總多糖以及轉(zhuǎn)化底物甘草總?cè)茷槭匈彯a(chǎn)品或自制產(chǎn)品，其中自制產(chǎn)品的制備方法為：將甘草總提取物濃縮液，或經(jīng)干燥后制得甘草總提取物粉末加水溶解，加有機試劑，優(yōu)選正丁醇、乙酸乙酯，再用酸堿調(diào)節(jié)體系pH6-7，搖勻萃取，體系靜置分層，有機相為含甘草總黃酮類成分，分出有機相，干燥后得甘草總黃酮粗品，水相為含甘草總?cè)坪透什菘偠嗵穷惓煞郑殖鏊啵佑袡C試劑，調(diào)節(jié)體系pH2.5-3.5，搖勻萃取，體系靜置分層，有機相為含甘草總?cè)祁惓煞郑酁楹懈什菘偠嗵穷惓煞郑殖鲇袡C相，干燥后得甘草總?cè)拼制罚捎谒嘀泻械某煞州^雜，先將水相所含蛋白質(zhì)除掉，優(yōu)選的方法是用sevag法除蛋白質(zhì)，再通過加95%乙醇或無水乙醇至乙醇濃度達到60～80%沉淀得甘草多糖，干燥后得甘草總多糖粗品。