[發(fā)明專利]一種二型登革熱病毒NS1蛋白的重鏈單域抗體及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310303381.6
• 申請日: 2013-07-18
• 公開（公告）號: CN103396481A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王菊芳;王海鷹;法蒂瑪;馬毅;王小寧
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/70;G01N33/577
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及針對二型登革熱病毒NS1蛋白產(chǎn)生的重鏈單域抗體。發(fā)明涉及編碼重鏈單域抗體的氨基酸序列以及采用羊駝非免疫庫篩選制備重鏈單域抗體的方法。得到的重鏈單域抗體能在大腸桿菌中高效表達(dá)，并能用于制備膠體金檢測試劑盒檢測二型登革熱病毒感染。

背景技術(shù)

登革熱是由登革熱病毒感染引起、依靠蚊子傳播的一種疾病。近十年來，全世界范圍內(nèi)登革熱感染日益增加，每年感染人數(shù)達(dá)到5000萬～1億。此病傳播迅速，發(fā)病率高，可通過現(xiàn)代化交通工具遠(yuǎn)距離傳播，故多發(fā)生在交通沿線及對外開放的城鎮(zhèn)。嚴(yán)重且致命的登革出血熱（dengue?hemorrhagic?fever，DHF）或登革休克綜合癥（dengue?shock?syndrome，DSS），其病死率可達(dá)12%-44%，是一種具有嚴(yán)重危害性的傳染病。目前登革熱感染診斷方法包括病毒分離、病毒核酸檢測、抗原抗體檢測以及這些方法的綜合運用【Kao?C.L.，Wu?M.C.，Chiu?Y.H.，et?al.Flow?cytometry?compared?with?indirect?immunofluorescence?for?rapid?detection?of?Dengue?virus?type1after?amplification?in?tissue?culture.J?Clin?Microbiol，2001，39:3672-3677.】。登革熱病毒基因編碼三個結(jié)構(gòu)蛋白（Structural?Protein）和七個非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural?protein，NS)【Cahour?A.，F(xiàn)algout?B.，Lai?C.J.Cleavage?of?the?dengue?virus?polyprotein?at?the?NS3/N84A?and?N84B/NS5junction?is?mediated?by?viral?proteinase?N82B-N83，whereas?NS4A/NS4B?may?be?processed?by?a?cellular?protease.J?Virol，1992，66:1525-1542.】。其中NS1是二型登革熱病毒基因中被認(rèn)為與免疫原性重要相關(guān)的一種非結(jié)構(gòu)蛋白，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在患者出現(xiàn)臨床癥狀后的1到6天之內(nèi)即可檢測出NS1的可溶性血清抗原；無論是初次感染還是再次感染患者，其NS1血清抗原都在第3到5天達(dá)到最高值【Alcon?S.，Talarmin?A.，Debruyne?M.，et?al.Enzyme-linked?immunosorbent?assay?specific?to?dengue?virus?type1nonstructural?protein?NS1reveals?circulation?of?the?antigen?in?the?blood?during?the?acute?phase?of?disease?in?patients?experiencing?primary?or?secondary?infections.J?Clin?Microbiol，2002，40:376-381.】。這些特性使NS1成為一種極有價值的分子標(biāo)記，用于快速診斷試劑盒的開發(fā)。

1993年，比利時科學(xué)家在駱駝血液中發(fā)現(xiàn)天然缺失輕鏈的重鏈抗體【Hamers-Casterman?C，Atarhouch?T，Muyldermans?S，et?al.Naturally?occurring?antibodies?devoid?of?light?chains.Nature1993，363:446–448.】，與傳統(tǒng)抗體相比，重鏈單域抗體具有分子量小、易表達(dá)、高特異性、高親和力等特點，且能識別獨特構(gòu)象的抗原表位，作為一種新型的基因工程抗體，在基礎(chǔ)科學(xué)研究、藥物開發(fā)等領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的前景【M.M.Harmsen，H.J.De?Haard.Properties，production，and?applications?of?camelid?single-domain?antibody?fragments.Appl?Microbiol?Biotechnol，2007，77:13-22.】。目前還未見有關(guān)二型登革熱病毒NS1蛋白的重鏈單域抗體的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供針對重組二型登革熱病毒NS1的重鏈單域抗體的氨基酸編碼序列及重鏈單域抗體的獨特制備方法，以及該抗體應(yīng)用于登革熱病毒感染的檢測應(yīng)用。

針對二型登革熱病毒NS1蛋白的重鏈單域抗體是由框架區(qū)和互補決定區(qū)組成，其中框架區(qū)FR1-FR4的氨基酸序列為：