[發(fā)明專利]檢測(cè)纖維二糖酶抑制劑的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310302482.1
• 申請(qǐng)日: 2013-07-18
• 公開（公告）號(hào): CN103411928A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃丹蓮;劉亮;曾光明;賴萃;張辰;許飄;趙美花;黃超;李寧杰;李雪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/55
• 分類號(hào): G01N21/55;C12Q1/34
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務(wù)所 43008
• 代理人: 趙洪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域中檢測(cè)酶抑制劑的方法，尤其涉及一種檢測(cè)纖維二糖酶抑制劑的方法。

背景技術(shù)

纖維素酶是由能降解木質(zhì)素的微生物分泌的一種多組分復(fù)合酶，它包括內(nèi)切型葡聚糖酶（EC3.2.1.4，也稱CX酶、CMC酶）、外切型葡聚糖酶（EC3.2.1.91，也稱C₁酶、微晶纖維酶）和纖維二糖酶（EC3.2.1.21，也稱β-葡萄糖苷酶）三種主要組分。普遍認(rèn)為在將天然纖維素降解成葡萄糖的過程中，必須依靠這三種組分的協(xié)同作用才能完成。纖維素大分子首先在C₁酶和C_X酶的作用下逐步降解成纖維二糖，而纖維二糖酶則進(jìn)一步將纖維二糖水解成葡萄糖。在利用纖維素酶制劑水解纖維素的過程中，常常由于纖維二糖酶的活力很低造成纖維二糖的累積，而纖維二糖又會(huì)對(duì)纖維素酶的催化作用形成強(qiáng)烈的反饋抑制。因此在纖維素酶解過程中提高纖維二糖酶的活力意味著提高纖維素水解效率和葡萄糖產(chǎn)量。

實(shí)際應(yīng)用中纖維二糖酶的活性會(huì)受到環(huán)境因素的抑制，例如土壤中的汞、銅等重金屬會(huì)通過富集作用進(jìn)入植物體內(nèi)，而木質(zhì)素降解功能微生物在處理這些含重金屬的植物殘?bào)w時(shí)，由于這些重金屬存在，會(huì)抑制木質(zhì)素降解功能微生物的生物活性，并且這些重金屬能使纖維二糖酶的必需基團(tuán)或活性部位的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活性降解或喪失，從而抑制纖維素的降解效率。因此一種特異性高效檢測(cè)纖維二糖酶活性抑制劑的方法能有效提高纖維二糖酶的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

目前，檢測(cè)纖維二糖酶活性抑制劑的方法普遍是基于纖維二糖酶活性測(cè)定方法，其中Barush和Swiain法是以水楊苷為酶反應(yīng)底物，檢測(cè)水解后產(chǎn)生的極微量的葡萄糖，反應(yīng)易受干擾，且檢測(cè)靈敏度不高；熒光法靈敏度高且快速，但是由于實(shí)驗(yàn)過程操作復(fù)雜，且重現(xiàn)性不好，現(xiàn)在應(yīng)用不多；比色法是以對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（pNPG）為酶底物，檢測(cè)底物水解后釋放出來的對(duì)硝基苯酚，而對(duì)硝基苯酚是一種很難被生物降解的、危害環(huán)境的高毒性有機(jī)物。因此，研究一種簡(jiǎn)便高效且對(duì)環(huán)境無害的纖維二糖酶抑制劑檢測(cè)方法是亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種更加快速、靈敏、且對(duì)環(huán)境無害、成本低廉的檢測(cè)纖維二糖酶抑制劑的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種檢測(cè)纖維二糖酶抑制劑的方法，該方法包括以下步驟：將一種可用于檢測(cè)纖維二糖酶抑制劑的納米金探針溶液加入含待測(cè)物質(zhì)的纖維二糖酶溶液中，所述納米金探針溶液與所述纖維二糖酶溶液的體積比為20∶1，其中每20體積的納米金探針溶液中含有2～4體積的納米金探針濃縮液（所述濃縮液為納米金探針制備時(shí)高速離心后的含納米金探針沉淀的濃縮液），將檢測(cè)溫度控制在30℃～35℃，檢測(cè)pH值控制在4.0～4.5，待納米金探針反應(yīng)完全后（一般至少反應(yīng)10min），檢測(cè)含待測(cè)物質(zhì)的溶液體系中納米金探針表面等離子體共振吸收峰強(qiáng)度變化，得到吸收峰在620nm處的吸光度與520nm處的吸光度比值A(chǔ)620/A520，設(shè)為A₂；同等條件下，即納米金探針溶液與纖維二糖酶溶液的體積比、檢測(cè)溫度、檢測(cè)pH值、反應(yīng)時(shí)間等條件均相同的情況下，將所述納米金探針溶液加入不含待測(cè)物質(zhì)的纖維二糖酶溶液中，檢測(cè)不含待測(cè)物質(zhì)的溶液體系中納米金探針表面等離子體共振吸收峰強(qiáng)度變化，得到吸收峰在620nm處的吸光度與520nm處的吸光度比值A(chǔ)620/A520，設(shè)為A1；比較含待測(cè)物質(zhì)的溶液體系中納米金探針表面等離子體共振吸收峰強(qiáng)度變化（以A₂為代表）和不含待測(cè)物質(zhì)的溶液體系中納米金探針表面等離子體共振吸收峰強(qiáng)度變化（以A₁為代表）的大小，即可判斷待測(cè)物質(zhì)是否為纖維二糖酶抑制劑（定性檢測(cè)）；

當(dāng)A₂＜A₁時(shí)，表明待測(cè)物質(zhì)為纖維二糖酶抑制劑，所述纖維二糖酶抑制劑對(duì)纖維二糖酶活性的抑制率計(jì)算方程為：