[發明專利]一種改性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法

有效

• 申請號: 201310301752.7
• 申請日: 2013-07-16
• 公開（公告）號: CN103396496A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 潘道東;楊媛;曾小群;曹錦軒;孫揚贏
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術領域

本發明涉及肽聚糖的制備方法，尤其是涉及一種改性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法。

背景技術

乳酸菌作為一種重要的腸道益生菌，在調節腸道微生物菌群、增強機體免疫力及預防腫瘤等疾病中具有重要作用。嗜酸乳桿菌是乳酸菌家族中重要一員，在調整腸道菌群平衡、降低血清膽固醇水平及刺激免疫系統、提高免疫功能等方面起著重要作用。嗜酸乳桿菌發揮免疫調節作用的原理主要是其肽聚糖通過誘導各種細胞因子的釋放進而調節宿主的免疫功能。

肽聚糖（peptidoglycan,PG），是細菌細胞壁的主要組成成分之一，它的單體是由一個四肽尾和一個雙糖單位構成。不同細菌的肽聚糖，其肽鏈的組成、長度及結構排列有很大變化，肽橋變化也甚多，溶解性和功能也不一樣，具有多樣性。如Reid?G,?Sakato?Y等人在2003年37卷第2期《J?Clin?Gastroenterol》中對雙歧桿菌肽聚糖進行了研究，發現肽聚糖是雙歧桿菌發揮抗感染、抗腫瘤以及免疫活性等多種生理功能的主要成分；《中國微生態學雜志》1999年11卷第3期中，藍景崗等發現PG能增強小鼠脾N?K、LAK細胞殺傷腫瘤靶細胞的活性；孫濤等在2007年《吉林農業大學學報》中初步研究發現嗜酸乳桿菌La2細胞壁肽聚糖能顯著抑制荷瘤小鼠S-180肉瘤的生長，提高荷瘤小鼠的脾指數及腎上腺指數。盡管PG具有較好的醫學價值，但目前國內外對其研究報道甚是少見，原因在于它本身溶解度低的特性，大大影響了其功效的發揮。現階段人們采用溶菌酶水解PG，破壞PG的β-1,4糖苷鍵結構，使PG的分子結構由大分子變成小分子，提高PG的溶解性。但溶菌酶價格昂貴，耗時較長，酶活力不容易控制，且得到的PG分子結構發生變化較大，不利于PG功效的研究及工業化。因此，對PG分子結構進行修飾顯得尤為重要。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種操作簡單，反應時間短，且溶解性顯著增加、抗氧化活性明顯提高的改性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種改性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法，包括以下步驟：

???（1）濕菌體的制備

????將嗜酸乳桿菌置于三角瓶中，于60-70℃水浴35-45min?加熱殺死菌體，然后加入0.5%Triton?X-100溶液，于80-90℃水浴0.5-1.5h，并不斷連續攪拌，取出溶液置冰浴中立即冷卻，于10000×g-15000×g離心8-12?min后棄上清，將沉淀再用雙蒸水充分洗滌兩次，再次于10000×g-15000×g離心8-12?min后棄上清，然后用甲醇-水、甲醇依次洗滌去除沉淀中的雜質后得到濕菌體；

???（2）酶解破壁

將濕菌體加入酶溶液Ⅰ中，于35-40℃水浴10-14?h，再于4℃、10000×g-15000×g離心30-50min棄上清，取沉淀加入酶溶液Ⅱ中，于35-40℃水浴10-14?h，再于4℃、10000×g-15000×g離心30-50min棄上清，取沉淀加入酶溶液Ⅲ中，于35-40℃水浴處理20min，再于4℃，10000×g-15000×g離心30-50min棄上清取沉淀；

???（3）去脂去蛋白

????將步驟（2）所得沉淀依次經甲醇、甲醇-氯仿及氯仿洗滌脫脂，于10000×g-15000×g離心35-45min后棄上清，取脫脂后的沉淀加入一定量的酶溶液Ⅳ中，于35-40℃消化10-15h，再于4℃，10000×g-15000×g離心30-50min，取沉淀加入酶溶液Ⅳ進行消化離心重復3次棄上清，得到去脂去蛋白沉淀；

???（4）純化

將步驟（3）得到的去脂去蛋白沉淀用去離子水在4℃條件下連續透析2.5-3.5d后，經0.01?mol/L的硫酸溶液于85-95℃?處理5min后，冰水浴中立即冷卻，再于4℃?、10000×g-15000×g離心25-35min棄上清,?取沉淀用去離子水在4℃條件下連續透析2.5-3.5d，冷凍干燥得到嗜酸乳桿菌肽聚糖；其中硫酸溶液與原料嗜酸乳桿菌的比例為2mL：3g；

????（5）TEMPO-NaClO-NaBr選擇性氧化修飾