[發明專利]一種改性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法

有效

• 申請號: 201310301752.7
• 申請日: 2013-07-16
• 公開（公告）號: CN103396496A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 潘道東;楊媛;曾小群;曹錦軒;孫揚贏
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

1.一種改性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

??（1）濕菌體的制備

???將嗜酸乳桿菌置于三角瓶中，于60-70℃水浴35-45min?加熱殺死菌體，然后加入0.5%Triton?X-100溶液，于80-90℃水浴0.5-1.5h，并不斷連續攪拌，取出溶液置冰浴中立即冷卻，于10000×g-15000×g離心8-12?min后棄上清，將沉淀再用雙蒸水充分洗滌兩次，再次于10000×g-15000×g離心8-12?min后棄上清，然后用甲醇-水、甲醇依次洗滌去除沉淀中的雜質后得到濕菌體；

??（2）酶解破壁

將濕菌體加入酶溶液Ⅰ中，于35-40℃水浴10-14?h，再于4℃、10000×g-15000×g離心30-50min棄上清，取沉淀加入酶溶液Ⅱ中，于35-40℃水浴10-14?h，再于4℃、10000×g-15000×g離心30-50min棄上清，取沉淀加入酶溶液Ⅲ中，于35-40℃水浴處理20min，再于4℃，10000×g-15000×g離心30-50min棄上清取沉淀；

??（3）去脂去蛋白

???將步驟（2）所得沉淀依次經甲醇、甲醇-氯仿及氯仿洗滌脫脂，于10000×g-15000×g離心35-45min后棄上清，取脫脂后的沉淀加入一定量的酶溶液Ⅳ中，于35-40℃消化10-15h，再于4℃，10000×g-15000×g離心30-50min，取沉淀加入酶溶液Ⅳ進行消化離心重復3次棄上清，得到去脂去蛋白沉淀；

??（4）純化

將步驟（3）得到的去脂去蛋白沉淀用去離子水在4℃條件下連續透析2.5-3.5d后，經0.01?mol/L的硫酸溶液于85-95℃?處理5min后，冰水浴中立即冷卻，再于4℃?、10000×g-15000×g離心25-35min棄上清,?取沉淀用去離子水在4℃條件下連續透析2.5-3.5d，冷凍干燥得到嗜酸乳桿菌肽聚糖；其中硫酸溶液與原料嗜酸乳桿菌的比例為2mL：3g；

??（5）TEMPO-NaClO-NaBr選擇性氧化修飾

???在燒杯中加入一定量的嗜酸乳桿菌肽聚糖和適量的蒸餾水，再加入一定量的四甲基哌啶（TEMPO）和NaBr，用玻璃棒攪拌均勻，制得肽聚糖乳液，在肽聚糖乳液中加入一定量的NaClO，控制溫度為4℃，調節pH為8.4-8.6，反應25-35min，加入Na₂SO₃還原未反應的微量氧化劑，加入少量乙醇終止反應，將反應液倒于過量的乙醇中，并不斷攪拌，靜置一段時間，抽濾得到濾餅，將濾餅用乙醇水溶液多次反復洗滌后，透析，冷凍干燥，得到氧化修飾的嗜酸乳桿菌肽聚糖產物。

2.根據權利要求1所述的一種改性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法，其特征在于：所述的酶溶液Ⅰ配制方法如下：氯化鎂0.1017?g?，胰蛋白酶50?mg?，DNase?5?mg，RNase?7.5mg，溶解于50mL?pH7.2?的Tris-HCl溶液中；所述的酶溶液Ⅱ配制方法如下：α-糜蛋白酶25mg?，胰蛋白酶25mg?，溶解于50ml?pH?7.2?的Tris-HCl溶液中；所述的酶溶液Ⅲ配制方法如下：胃蛋白酶30?mg，溶解于30mL?0.01?mol/L的鹽酸溶液中；所述的酶溶液Ⅳ配制方法如下：蛋白酶E?80?mg，溶解于80mL的pH?7.4的Tris-HCl溶液中。

3.根據權利要求2所述的一種改性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法，其特征在于：所述的嗜酸乳桿菌與所述的Triton?X-100溶液的混合比例為3g：10mL，?所述的嗜酸乳桿菌與所述的酶溶液Ⅰ的比例為3g：8mL，所述的酶溶液Ⅰ、所述的酶溶液Ⅱ、所述的酶溶液Ⅲ與所述的酶溶液Ⅳ的比例為2：2：1：1；所述的甲醇-水中甲醇與水的體積比為2：l；?所述的甲醇-氯仿中甲醇與氯仿的體積比為1:1。

4.根據權利要求1-3中任一項所述的一種改性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法，其特征在于：所述的嗜酸乳桿菌肽聚糖、所述的蒸餾水、所述的四甲基哌啶、所述的NaBr和所述的NaClO的混合比例為200mg：20ml：5mg：48mg：0.3-0.5mmol，所述的乙醇水溶液中乙醇與水的體積比為7：3。