[發明專利]一種試劑盒以及安氏隱孢子蟲的檢測方法

有效

• 申請號: 201310301656.2
• 申請日: 2013-07-17
• 公開（公告）號: CN103451278A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 李軍;彭昊;陶立;謝永平;韋志鋒;秦若甫;蘭美益;潘艷;禤雄標;胡帥;謝宇舟;馬春霞;楊威;陳澤祥
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李彥孚;吳偉文

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技術領域

本發明涉及微生物檢測技術領域，具體涉及一種安氏隱孢子蟲的檢測方法以及該方法所采用的試劑盒。

背景技術

隱孢子蟲(Cryptosporidium?Tyzzer)是一種危害嚴重的機會性致病人獸共患胃腸道原蟲，卵囊污染水源、食物等造成隱孢子蟲病暴發流行，宿主廣泛，可感染包括人在內的多種動物。在絕大部分地面水、受地面水污染的淺井和防護條件較差的深井水、處理不良的自來水、處理或未處理過的排放污水、經過濾的游泳池水中，均可檢出隱孢子蟲卵囊（沈玉娟等，2005）。安氏隱孢子蟲(Cryptosopridium?andersoni)主要感染斷奶犢牛、育成牛和成年牛（Paul等，2009），感染奶牛后可引起奶牛產奶量下降，體質變弱，是影響奶牛業發展的重要致病因素之一（任文陟等，2010）。

傳統檢測方法如糞便濃集、改良抗酸染色和免疫熒光染色法等檢測卵囊步驟繁瑣，敏感性低，許多干擾因素如酵母、飼料顆粒以及腸道內容物等均影響檢測效果（陳甫等，2006）。而目前使用最普遍的分子生物學檢測隱孢子蟲方法為Xiao等建立的Nest-PCR?-RFLP（Xiao等，1999），特點是通用性好，可檢測目前發現的所有隱孢子蟲種類，但需要兩輪PCR以及酶切鑒定的過程方能定種，耗時較長。鑒于安氏隱孢子蟲的危害性，急需建立一種快速檢測方法。

Notomi等在2000年報道了一種新的DNA擴增技術-環介導等溫擴增（簡稱LAMP）技術，該技術具有方法簡單、快速、特異性強的特點，而且不需要PCR儀，肉眼可判斷結果及反應時間短等優點。該技術中所用到的LAMP方法檢測需1小時后加入染料才能判斷結果，反應中加入的熒光染料syber-green，需采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像，存在開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠污染，缺乏對反應的實時監控很難排除這些干擾因素，不能對檢測結果做出準確的判定，這已成為限制LAMP技術進一步發展的一大難題。

發明內容

本發明的目的是提供一種為基層簡便、快捷準確地檢測安氏隱孢子蟲的方法，公開一種安氏隱孢子蟲的檢測方法以及該方法所采用的試劑盒。

本發明提供的試劑盒，包括LAMP引物、2×反應緩沖液、Bst?DNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、超純水和預先處理的安氏隱孢子蟲陽性模板；所述的LAMP引物包括外引物、內引物及環引物；

所述的外引物是F3和B3；

所述的內引物是FIP和BIP；

所述的環引物是LF和LB；

其中引物的序列分別為：

F3???CAGGTTTTACATTTTCAGGGAA

B3??CATACATTGCTGCCCAGA

FIP?GCATGTTCCATTCTCCAATACAGTCAGTCTGATACTGCACCTCC

BIP?GCAAGTAGATACTATATGCCCACCTTGGACATATTTTGTTTGCTGG

LF?CCAGGAGGACATTCAGGGTT

LB?GAGGAGGGAAATAGATGTGTCCAG；

各組分的份量為：

F3???????????????????????100μl

B3???????????????????????100μl

FIP??????????????????????100μl

BIP??????????????????????100μl

LF???????????????????????100μl

LB???????????????????????100μl

2×反應緩沖液?????????????12.5μl

Bst?DNA聚合酶????????????60μl

熒光目視檢測試劑??????????0.1ml

超純水????????????????????1ml

安氏隱孢子蟲陽性模板??????100μl；