[發明專利]一種試劑盒以及安氏隱孢子蟲的檢測方法

有效

• 申請號: 201310301656.2
• 申請日: 2013-07-17
• 公開（公告）號: CN103451278A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 李軍;彭昊;陶立;謝永平;韋志鋒;秦若甫;蘭美益;潘艷;禤雄標;胡帥;謝宇舟;馬春霞;楊威;陳澤祥
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李彥孚;吳偉文

1.一種試劑盒，其特征在于：包括LAMP引物、2×反應緩沖液、Bst?DNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、超純水和預先處理的安氏隱孢子蟲陽性模板，所述的LAMP引物包括外引物、內引物及環引物；

所述的外引物是F3和B3；

所述的內引物是FIP和BIP；

所述的環引物是LF和LB；

其中引物的序列分別為：

F3??CAGGTTTTACATTTTCAGGGAA

B3??CATACATTGCTGCCCAGA

FIP?GCATGTTCCATTCTCCAATACAGTCAGTCTGATACTGCACCTCC

BIP?GCAAGTAGATACTATATGCCCACCTTGGACATATTTTGTTTGCTGG

LF?CCAGGAGGACATTCAGGGTT

LB?GAGGAGGGAAATAGATGTGTCCAG；

各組分的份量為：

F3???????????????????????????????100μl

B3???????????????????????????????100μl

FIP??????????????????????????????100μl

BIP??????????????????????????????100μl

LF???????????????????????????????100μl

LB???????????????????????????????100μl

2×反應緩沖液????????????????12.5μl

Bst?DNA聚合酶???????????????60μl

熒光目視檢測試劑????????????0.1ml

超純水???????????????????????????1ml

安氏隱孢子蟲陽性模板??????100μl；

所述的2×反應緩沖液包括Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和dNTPs。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素熒光試劑，熒光試劑在反應前加入。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的安氏隱孢子蟲陽性模板預先處理步驟是取待檢牛的新鮮糞便20.0~50.0g，置滅菌燒杯充分攪勻，稱取攪拌后的糞便樣本180~220mg于2ml離心管中，反復凍融3~5次，按糞便基因組DNA提取說明書提取。

4.安氏隱孢子蟲的檢測方法，其特征在于：使用權利要求1所述的試劑盒，具體檢測步驟如下：

1）LAMP引物的設計與合成；

2）LAMP反應體系的建立；?

3）LAMP擴增，判斷樣品中菌種的種類。

5.根據權利要求4所述安氏隱孢子蟲的檢測方法，其特征在于：所述的LAMP反應體系以25μl計：

2×反應緩沖液????????????????????????????12.5μl

F3????????????????????????????????????????????5pmol

B3????????????????????????????????????????????5pmol

FIP???????????????????????????????????????????40pmol

BIP??????????????????????????????????????????40pmol

LF????????????????????????????????????????????20pmol

LB????????????????????????????????????????????20pmol

安氏隱孢子蟲陽性模板??????????????????2μl

超純水???????????????????????????????????????補足25μl。

6.根據權利要求5所述安氏隱孢子蟲的檢測方法，其特征在于：所述的判斷樣品菌株的方法采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測。