[發(fā)明專利]一種磷酸化肽聚糖的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310301417.7
• 申請日: 2013-07-16
• 公開（公告）號: CN103397060A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 潘道東;王琳珺;曾小群;孫揚(yáng)贏;曹錦軒
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號: C12P19/14
• 分類號: C12P19/14;C12P19/04;C12R1/23
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種肽聚糖的制備方法，尤其是涉及一種磷酸化肽聚糖的制備方法。

背景技術(shù)

乳酸菌作為一種重要的腸道益生菌，在調(diào)節(jié)腸道微生物菌群、增強(qiáng)機(jī)體免疫力及預(yù)防腫瘤等疾病中具有重要作用。近年來國內(nèi)外除了關(guān)注長期研究的雙歧桿菌、枯草桿菌外，又開始將目標(biāo)鎖定于另一重要成員——嗜酸乳桿菌。此類細(xì)菌利用特有的肽聚糖成分誘導(dǎo)各種細(xì)胞因子的釋放進(jìn)而調(diào)節(jié)宿主的免疫功能。

肽聚糖，是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要組成成分之一。它的單體是由一個四肽尾和一個雙糖單位構(gòu)成。這種微生物多糖因其肽段結(jié)構(gòu)的特殊性、糖類聚合鏈的長短性，而具有不同的免疫效用。如《微生物學(xué)通報》2007年34卷第1期的姚光國等人就以小鼠為模型研究乳酸菌肽聚糖的免疫增強(qiáng)作用，結(jié)果表明肽聚糖能提高雞新城疫疫苗免疫效果；張悅等人在2006年13卷第4期的《中國水產(chǎn)科學(xué)》中對肽聚糖分子量的大小與免疫關(guān)系進(jìn)行研究，最后發(fā)現(xiàn)低分子量肽聚糖的增加有利于免疫效應(yīng)的增強(qiáng)。雖然肽聚糖具有良好的免疫增強(qiáng)作用，但目前對于它的研究和產(chǎn)品開發(fā)甚是少見，究其原因在于它本身的低溶解性，由于溶解性問題也使肽聚糖只局限在固體免疫增強(qiáng)佐劑領(lǐng)域。

?磷酸化分子修飾是一種共價修飾，是支鏈上的羥基被磷酸根取代的過程，從而有助于糖類的免疫效應(yīng)、抗腫瘤能力、抗凝血能力的進(jìn)一步增強(qiáng)。但是目前關(guān)于磷酸化修飾主要集中在淀粉、殼聚糖和纖維素等，肽聚糖磷酸化修飾方面的研究至今未見有報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種溶解性顯著增加、免疫效應(yīng)有所提高的磷酸化肽聚糖的制備方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種磷酸化肽聚糖的制備方法，具體包括以下步驟：

（1）肽聚糖的制備

???a.菌體收集：將活化的嗜酸乳桿菌按體積百分比3-5%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，37-40℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)16-24h，5000-8000r/min離心10-20min收集菌體，并用蒸餾水反復(fù)洗滌直至菌體呈乳白色；

???b.去磷壁酸：將步驟a得到的菌體按1g:9ml的固液比懸浮于濃度為40-50%的氫氟酸溶液中，4℃放置過夜，7000-9000?r/min離心10-20min收集不含磷壁酸的細(xì)胞壁沉淀，并用蒸餾水洗滌沉淀至中性；

???c.酶解破壁：將步驟b得到的沉淀按2g:5ml的固液比溶于糜胰蛋白酶磷酸緩沖液中，37-40℃搖床110-130r/min振蕩15-17h，沸水浴滅活4-6min，于1500-2500r/min的轉(zhuǎn)速下離心4-6min，棄去未溶解的蛋白酶沉淀，將上清液于8000-12000r/min離心10-20min，得到的沉淀用蒸餾水離心洗滌；

???d.除脂：將步驟c洗滌后得到的沉淀按1g:1ml的固液比溶于乙醚中，攪拌3-5h后，7000-9000r/min離心10-20min收集沉淀，用蒸餾水洗滌至無乙醚味得到肽聚糖；

?（2）降低分子量：

????將肽聚糖按1g:5ml的固液比溶于溶菌酶磷酸緩沖液中，36-38℃攪拌酶解6-10h，于1500-2500r/min的轉(zhuǎn)速下離心4-6min，取上清液，再將上清液于8000-12000r/min離心10-20min，取沉淀用蒸餾水離心洗滌，得到小分子肽聚糖；

（3）混合磷酸鹽修飾

將小分子肽聚糖按1g:10ml的固液比溶于濃度為0.003-0.006g/ml的復(fù)合磷酸鹽溶液中，75-85℃反應(yīng)4-6h后，再將反應(yīng)液用8倍反應(yīng)液體積的95%乙醇沉淀20-28h，將醇沉肽聚糖冷凍干燥，再于55-65℃水浴中復(fù)溶，復(fù)溶后的溶液置于截留分子量為7000的透析袋中，以蒸餾水為透析液透析2-3天后，將透析袋內(nèi)液體濃縮到2-5ml后，進(jìn)行冷凍干燥得到磷酸化肽聚糖。

?所述的MRS液體培養(yǎng)基的配制方法如下：將蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，檸檬酸三胺2g，磷酸氫二鉀2g，醋酸鈉5g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25，吐溫80?1ml，加蒸餾水定容至1000ml，調(diào)節(jié)pH?至7.2-7.4即可。

??所述的糜胰蛋白酶磷酸緩沖液的配制方法如下：將150mg胰蛋白酶和25mg?α-糜蛋白酶溶于50mL的0.1mol/L磷酸鈉緩沖液中即可，其pH為8.0。

?所述的溶菌酶磷酸緩沖液的配制方法如下：將10mg溶菌酶和200μg變?nèi)芫厝苡?0mL的0.1mol/L磷酸鈉緩沖液中即可，其pH為5.8。