[發明專利]一種磷酸化肽聚糖的制備方法

有效

• 申請號: 201310301417.7
• 申請日: 2013-07-16
• 公開（公告）號: CN103397060A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 潘道東;王琳珺;曾小群;孫揚贏;曹錦軒
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12P19/14
• 分類號: C12P19/14;C12P19/04;C12R1/23
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

1.一種磷酸化肽聚糖的制備方法，其特征具體包括以下步驟：

（1）肽聚糖的制備

?a.菌體收集：將活化的嗜酸乳桿菌按體積百分比3-5%的接種量接種于MRS液體培養基，37-40℃恒溫培養箱靜置培養16-24h，5000-8000r/min離心10-20min收集菌體，并用蒸餾水反復洗滌直至菌體呈乳白色；

?b.去磷壁酸：將步驟a得到的菌體按1g:9ml的固液比懸浮于濃度為40-50%的氫氟酸溶液中，4℃放置過夜，7000-9000?r/min離心10-20min收集不含磷壁酸的細胞壁沉淀，并用蒸餾水洗滌沉淀至中性；

c.酶解破壁：將步驟b得到的沉淀按2g:5ml的固液比溶于糜胰蛋白酶磷酸緩沖液中，37-40℃搖床110-130r/min振蕩15-17h，沸水浴滅活4-6min，于1500-2500r/min的轉速下離心4-6min，棄去未溶解的蛋白酶沉淀，將上清液于8000-12000r/min離心10-20min，得到的沉淀用蒸餾水離心洗滌；

?d.除脂：將步驟c洗滌后得到的沉淀按1g:1ml的固液比溶于乙醚中，攪拌3-5h后，7000-9000r/min離心10-20min收集沉淀，用蒸餾水洗滌至無乙醚味得到肽聚糖；

（2）降低分子量：

?將肽聚糖按1g:5ml的固液比溶于溶菌酶磷酸緩沖液中，36-38℃攪拌酶解6-10h，于1500-2500r/min的轉速下離心4-6min，取上清液，再將上清液于8000-12000r/min離心10-20min，取沉淀用蒸餾水離心洗滌得到小分子肽聚糖；

（3）混合磷酸鹽修飾

?將小分子肽聚糖按1g:10ml的固液比溶于濃度為0.003-0.006g/ml的復合磷酸鹽溶液中，75-85℃反應4-6h后，再將反應液用8倍反應液體積的95%乙醇沉淀20-28h，將醇沉肽聚糖冷凍干燥，再于55-65℃水浴中復溶，復溶后的溶液置于截留分子量為7000的透析袋中，以蒸餾水為透析液透析2-3天后，將透析袋內液體濃縮到2-5ml后，進行冷凍干燥得到磷酸化肽聚糖。

2.根據權利要求1所述的一種磷酸化肽聚糖的制備方法，其特征在于所述的MRS液體培養基的配制方法如下：將蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，檸檬酸三胺2g，磷酸氫二鉀2g，醋酸鈉5g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25，吐溫80?1ml，加蒸餾水定容至1000ml，調節pH?至7.2-7.4即可。

3.根據權利要求1所述的一種磷酸化肽聚糖的制備方法，其特征在于所述的糜胰蛋白酶磷酸緩沖液的配制方法如下：將150mg胰蛋白酶和25mg?α-糜蛋白酶溶于50mL的0.1mol/L磷酸鈉緩沖液中即可，其pH為8.0。

4.根據權利要求1所述的一種磷酸化肽聚糖的制備方法，其特征在于所述的溶菌酶磷酸緩沖液的配制方法如下：將10mg溶菌酶和200μg變溶菌素溶于50mL的0.1mol/L磷酸鈉緩沖液中即可，其pH為5.8。

5.根據權利要求1所述的一種磷酸化肽聚糖的制備方法，其特征在于：所述的復合磷酸鹽溶液由三聚磷酸鈉溶液和三偏磷酸鈉溶液按按5:1的質量比混合而成。