[發(fā)明專利]用于鑒定金花茶的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310300890.3
• 申請日: 2013-07-17
• 公開（公告）號(hào): CN104293776A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋云;趙竹;徐晗
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及用于鑒定金花茶的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用。?

背景技術(shù)

金花茶(Camellia?nitidissima?Chi)屬于山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)金花茶組(Sect.chrysantha)的常綠灌木，因其花冠呈黃色而具有重要的園藝價(jià)值，被譽(yù)為“茶花皇后”。近年來，由于棲息地的喪失，瀕危物種資源的過度采集和非法出口貿(mào)易，其自然種群急劇下降。金花茶被列為國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物，IUCN紅色名錄中最瀕危的植物種類之一。因此，建立準(zhǔn)確的金花茶植物鑒定方法是其生物多樣性保護(hù)和研究的關(guān)鍵。?

單核苷酸多態(tài)性(single?nucleotide?polymorphism,SNP)是指在基因組水平上由于單個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等所引起的堿基序列多態(tài)性，與其它類型分子標(biāo)記相比具有數(shù)量豐富、分布廣泛、遺傳穩(wěn)定性高、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析等優(yōu)勢(Mochida?et?al.,2003)。目前SNP的檢測分析方法，如：DNA直接測序法、基因芯片技術(shù)、陣列雜交分析、高效變性液相色譜檢測等(Jehan?and?Lakhanpaul,2006)，但是由于技術(shù)繁瑣、成本高，限制了其應(yīng)用。酶切擴(kuò)增多態(tài)性（cleaved?amplified?polymorphic?sequence,CAPS）標(biāo)記是根據(jù)SNPs位點(diǎn)的DNA序列設(shè)計(jì)特異的PCR引物，與限制性內(nèi)切酶相結(jié)合產(chǎn)生的一種分子標(biāo)記。但SNP恰好位于限制性酶切位點(diǎn)這種情況比較少，為了更有效地檢測SNPs，衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性（derived?cleaved?amplified?polymorphic?sequence,dCAPS）技術(shù)在CAPS標(biāo)記基礎(chǔ)上通過在引物中引入錯(cuò)配堿基，結(jié)合SNP位點(diǎn)引入新的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，從而達(dá)到?酶切檢測SNPs的目的(Michaels?and?Amasino,1998)。dCAPS技術(shù)自發(fā)明以來大量應(yīng)用于分子遺傳學(xué)及種質(zhì)資源品種品系鑒定等方面研究，該技術(shù)已在水稻(Komori?and?Nitta,2005)、擬南芥(Nemri?et?al.,2007;Hou?et?al.,2010)、小麥(Yanagisawa?et?al.,2003)、大麥(Shahinnia?and?Sayed-Tabatabaei,2009)、葡萄(Boss?and?Thomas,2002)、香蕉(P.UMALI?and?NAKAMURA,2003)、山茶(張成才等，2012)等作物中得到了廣泛的應(yīng)用。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基于金花茶SNP位點(diǎn)建立dCAPS分子標(biāo)記體系，從而快速鑒定金花茶物種的方法。?

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種用于鑒定金花茶的SNP分子標(biāo)記，其位于如SEQ?ID?NO.1所示的金花茶GBSSI基因的第141位堿基，此處堿基為T，則鑒定為金花茶物種。?

本發(fā)明還提供所述SNP分子標(biāo)記在金花茶分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。?

本發(fā)明還提供用于PCR檢測金花茶的特異性引物對，包括上游引物F5’-CTGTGGACGCAAACATCCACTTGAT-3’和下游引物R5’-CCATGTATTTCTTGCCAGTGCCCT-3’。?

本發(fā)明還提供一種鑒定金花茶的方法，包括以下步驟：1）提取待測植物的基因組DNA；2）以待測植物的基因組DNA為模板，利用上述引物F和R，PCR擴(kuò)增金花茶GBSSI基因；3）檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。?

具體地，步驟3）中采用酶切法檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果呈現(xiàn)2條帶，則待測植物為金花茶物種。其中，酶切使用的限制性內(nèi)切酶為BstXI。?

前述方法中，25μL?PCR反應(yīng)體系中包括：添加Mg²⁺的10×EX?Taq緩沖液2.5μL，2.5mM?dNTPs2μL，10μM上、下游引物各1μL，5U/μL?EX?Taq?DNA聚合酶0.2μL，50μg/μL基因組DNA1μL，余量為ddH₂O。?

前述方法中，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。?

本發(fā)明還提供含有所述引物F和R的用于檢測金花茶的試劑盒。優(yōu)選所述試劑盒還包括dNTPs、Taq?DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應(yīng)緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板等中的一種或多種。?