[發(fā)明專利]聚乙烯吡咯烷酮修飾小麥酯酶的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310300705.0
• 申請日: 2013-07-18
• 公開（公告）號: CN103333877A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陸利霞;熊曉輝;陳銘;游京晶
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種采用聚乙烯吡咯烷酮修飾小麥酯酶的制備方法，屬于小麥酯酶修飾利用領(lǐng)域，具體涉小麥酯酶的修飾方法并提高了酶比活力。

背景技術(shù)

有機磷類及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的使用廣泛，是我國常用農(nóng)藥種類。因此，使用不當(dāng)時，常導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品殘留，而影響食品安全質(zhì)量。

目前，有機磷類及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測方法包括色譜法、酶聯(lián)免疫分析法、酶抑制法等。色譜法需要特殊、昂貴的儀器且檢測費用高。酶聯(lián)免疫分析法，具有靈敏度高、特異性強、檢出限低、操作簡便快捷的優(yōu)點，但有一定的局限性，因為酶聯(lián)免疫法特異性強，一般一種試劑盒只能檢測一種有機磷，不能檢測到有機磷的總量，檢測過程中具有一定的盲目性，且有機磷抗體制作過程難度較大，并且檢測成本相對較高。酶抑制法是目前研究比較多且比較成熟的一種對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留快速檢測的一種技術(shù)。所用的酶包括動物來源的膽堿酯酶及植物來源的酯酶。動物膽堿酯酶抑制法具有快速、簡便、靈敏等優(yōu)點，但其來源于動物體，取材不易，且保存條件苛刻。植物酯酶具有酶源豐富、取材方便、成本低和保存方便的優(yōu)勢，而且農(nóng)藥的靈敏度和檢出限與動物膽堿酯酶相當(dāng)，精密度甚至更好。對小麥酯酶修飾并對其穩(wěn)定性的提高，利于酶抑制法檢測有機磷類及氨基甲酸酯類農(nóng)藥。

對小麥酯酶的研究包括不同品種小麥比較、酶的提取制備方法以及用于有機磷農(nóng)藥檢測方法的開發(fā)等。相關(guān)專利有快速測定有機磷農(nóng)藥的植物酯酶片(CN99114268.3)、殘留有機磷農(nóng)藥快速測試盒及制造方法(CN00135716.6)、快速檢測痕量有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥的方法(CN01144343.X)、一種小麥酯酶生物傳感器的制備方法(CN200910072241.6)、一種快速檢測食品中農(nóng)藥殘留量的試紙條(CN201120345140.4)、一種檢測微痕量克百威的方法(CN201210346004.6)、一種檢測微痕量甲基磷酸二甲酯的方法(CN200710092751.0)等。

小麥酯酶及其他植物酯酶是實現(xiàn)酶抑制法檢測農(nóng)藥殘留的關(guān)鍵材料之一。通過一定方法提高小麥酯酶比活力及穩(wěn)定性是開發(fā)農(nóng)藥殘留檢測方法、降低檢測成本等關(guān)鍵之一。通過對小麥酯酶進行修飾是提高小麥酯酶比活力及穩(wěn)定性的有效手段之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了獲得適于有機磷類及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測的小麥酯酶修飾酶，提高現(xiàn)有制備的小麥酯酶的比活力及熱穩(wěn)定性，降低小麥酯酶法檢測有機磷類及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測成本。同時提供一種新的小麥酯酶修飾方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：聚乙烯吡咯烷酮修飾小麥酯酶的制備方法。其具體步驟為：對提取制備的小麥酯酶用氧化的聚乙烯吡咯烷酮進行修飾，從而提高小麥酯酶的比活力及熱穩(wěn)定性。降低酶抑制法檢測有機磷類及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的成本。

其中所述的提取制備的小麥酯酶為從小麥面粉中以0.05～0.15mol/L的NaCl的溶液，料液體積比1∶2～6(m∶v)，在28～40℃的振蕩提取40～120min，再經(jīng)雙層紗布過濾，取得的濾液在3000～6000r/min，4℃離心5～10min，收集上清液；進而以20％-70％硫酸銨鹽析，4℃條件10000r/min離心15～20min收集沉淀，將沉淀采用截留分子量為8000～14000Da透析袋，將透析袋放入蒸餾水透析脫除硫酸銨。即為制備的小麥酯酶。

所述的氧化的聚乙烯吡咯烷酮為將高碘酸鈉與聚乙烯吡咯烷酮(2～4∶1，m∶m)溶于40～100mL蒸餾水中，25℃避光攪拌反應(yīng)20～36h后，將所得產(chǎn)物用截留分子量為8000～14000Da的透析袋在蒸餾水中透析10～20h，得到聚乙烯吡咯烷酮的氧化溶液。

所述的小麥酯酶用氧化的聚乙烯吡咯烷酮進行修飾為將制備得到的小麥酯酶與氧化的聚乙烯吡咯烷酮溶液按體積比為1∶1～20(v∶v)混合后，在避光25℃下，振蕩10～20h后，加入0.1～0.3mol/LNaBH₄溶液1～2mL繼續(xù)振蕩4～6h終止反應(yīng)，調(diào)至pH7.0～8.0，得到聚乙烯吡咯烷酮修飾小麥酯酶.

所述的修飾的小麥酯酶米氏方程中Vmax值增大，Km值減小，小麥酯酶對底物乙酸-1-萘酯的親和力增強，酶比活力提高至原酶活的130～150％，25℃～45℃酶活在100min內(nèi)保持穩(wěn)定。

原酶與修飾酶的酶學(xué)性質(zhì)：

修飾酶的Km為原酶1/3，(以乙酸-1-萘酯為底物)，為1.1mmol/L。最大反應(yīng)速率較原酶增加33～40％。

原酶與修飾酶的熱穩(wěn)定性分別為15～65℃。