[發明專利]SNP位點基因型分型的方法

有效

• 申請號: 201310298870.7
• 申請日: 2013-07-16
• 公開（公告）號: CN104293896A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 張德強;徐煲鏵;杜慶章
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 吳貴明;張永明

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體而言，涉及一種SNP位點基因型分型的方法。

背景技術

鎖核酸（Locked?nucleic?acid，LNA）是指核苷酸糖環上的2'-O與4'-C由亞甲基橋相連的一類RNA衍生物，可以與DNA或RNA按照一般的堿基配對原則進行配對。這種橋連結構增加了核酸骨架的穩定性，提高了退火溫度，增強了堿基配對的特異性，極大的降低了錯配發生的概率。因此鎖核酸在基因芯片、RNA干擾等許多領域得到了廣泛的應用（Braasch,D.A.and?D.R.Corey,Locked?nucleic?acid(LNA):fine-tuning?the?recognition?of?DNA?and?RNA.Chemistry&biology,2001.8(1):p.1-7.）。

理論上，聚合酶鏈式反應（Polymerase?Chain?Reaction，PCR）的順利進行是以模板單鏈與引物鏈按照堿基配對原則正確配對為前提。所以，在包含堿基差異的區域，設計一組只有單堿基差異的PCR引物，利用常見的PCR擴增儀，進行擴增，檢測是否有符合設計片段長度的擴增產物產生，可以判斷目標區域靶位點的堿基類型。但在使用常規PCR引物時，即使存在單堿基的錯配，PCR反應有時也可以正常進行，得到與目的片段長度相同的擴增產物。因而使用常規引物進行PCR擴增分型時，無法排除假陽性結果，進而可能會得到錯誤的基因型分型結果。

目前，常用的SNP位點基因型檢測方法主要有測序法、芯片法以及質譜法等，其中測序法價格比較昂貴，而芯片法和質譜法只有在同時測定多個位點或研究大群體樣品時較有優勢，且這三種方法都必須以相關的大型儀器平臺作為支撐，存在多種局限。

發明內容

本發明旨在提供一種SNP位點基因型分型的方法，以解決現有技術中SNP位點基因型分型技術假陽性高或復雜、價格昂貴的技術問題。

為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種SNP位點基因型分型的方法。該方法包括以下步驟：S1，對目標區域的DNA序列進行克隆測序和多重比對，確定待測SNP位點；S2，針對SNP位點設計PCR擴增引物，PCR擴增引物中的正向引物或反向引物的3'末端對應待測SNP位點，對對應待測SNP位點的3'末端上的核苷酸進行LNA修飾；S3，采用PCR擴增引物對待測樣本的DNA進行擴增，并根據擴增產物中目的條帶的有無確定待測樣本的SNP位點基因型。

優選地，步驟S3中采用PCR擴增引物對待測樣本的DNA進行擴增是在通過梯度實驗得到的最佳PCR擴增條件和反應體系下進行的。

優選地，對PCR擴增引物中的與模板雜交親和程度高的引物3'末端進行LNA修飾。

優選地，PCR擴增引物中的正向引物或反向引物的3'末端倒數第一個或倒數第二個核苷酸對應待測SNP位點。

優選地，待測樣本為毛白楊，待測SNP位點位于纖維素合酶基因5上，PCR擴增引物的堿基序列為SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:3；SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2的3'末端上的倒數第一個核苷酸進行LNA修飾。

優選地，待測樣本為毛白楊，待測SNP位點位于纖維素合酶基因5上，PCR擴增引物的堿基序列為SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:5和SEQ?ID?NO:6；SEQ?ID?NO:5和SEQ?ID?NO:6的3'末端上的倒數第一個核苷酸進行LNA修飾。

優選地，待測樣本為毛白楊，待測SNP位點位于纖維素合酶基因8上，PCR擴增引物的堿基序列為SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:8和SEQ?ID?NO:9；SEQ?ID?NO:8和SEQ?ID?NO:9的3'末端上的倒數第二個核苷酸進行LNA修飾。

優選地，PCR擴增的條件為：預變性95℃5min，變性95℃30s，退火58～65℃30s或20s，延伸72℃1min，30個循環，最后延伸72℃10min。

優選地，PCR擴增的體系為：20ng基因組DNA，0.8UTaq酶，0.2mMdNTPs，10×PCR?buffer以及50ng正向引物和50ng反向引物，補充水至25μl。