[發(fā)明專利]SNP位點(diǎn)基因型分型的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310298870.7
• 申請(qǐng)日: 2013-07-16
• 公開（公告）號(hào): CN104293896A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張德強(qiáng);徐煲鏵;杜慶章
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京康信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11240
• 代理人: 吳貴明;張永明

1.一種SNP位點(diǎn)基因型分型的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1，對(duì)目標(biāo)區(qū)域的DNA序列進(jìn)行克隆測(cè)序和多重比對(duì)，確定待測(cè)SNP位點(diǎn)；

S2，針對(duì)所述SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，所述PCR擴(kuò)增引物中的正向引物或反向引物的3'末端對(duì)應(yīng)所述待測(cè)SNP位點(diǎn)，將對(duì)應(yīng)所述待測(cè)SNP位點(diǎn)的所述3'末端上的核苷酸進(jìn)行LNA修飾；

S3，采用所述PCR擴(kuò)增引物對(duì)待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物中目的條帶的有無確定所述待測(cè)樣本的SNP位點(diǎn)基因型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S3中采用所述PCR擴(kuò)增引物對(duì)待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增是在通過梯度實(shí)驗(yàn)得到的最佳PCR擴(kuò)增條件和反應(yīng)體系下進(jìn)行的。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)PCR擴(kuò)增引物中的與模板雜交親和程度高的引物3'末端進(jìn)行LNA修飾。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增引物中的正向引物或反向引物的3'末端倒數(shù)第一個(gè)或倒數(shù)第二個(gè)核苷酸對(duì)應(yīng)所述待測(cè)SNP位點(diǎn)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣本為毛白楊，所述待測(cè)SNP位點(diǎn)位于纖維素合酶基因5上，所述PCR擴(kuò)增引物的堿基序列為SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:3，所述SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2的3'末端上的倒數(shù)第一個(gè)核苷酸進(jìn)行LNA修飾。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣本為毛白楊，所述待測(cè)SNP位點(diǎn)位于纖維素合酶基因5上，所述PCR擴(kuò)增引物的堿基序列為SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:5和SEQ?ID?NO:6；所述SEQ?ID?NO:5和SEQ?ID?NO:6的3'末端上的倒數(shù)第一個(gè)核苷酸進(jìn)行LNA修飾。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣本為毛白楊，所述待測(cè)SNP位點(diǎn)位于纖維素合酶基因8上，所述PCR擴(kuò)增引物的堿基序列為SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:8和SEQ?ID?NO:9；所述SEQ?ID?NO:8和SEQ?ID?NO:9的3'末端上的倒數(shù)第二個(gè)核苷酸進(jìn)行LNA修飾。

8.根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性95℃5min，變性95℃30s，退火58～65℃30s或20s，延伸72℃1min，30個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃10min。

9.根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的體系為：20ng基因組DNA，0.8UTaq酶，0.2mM?dNTPs，10×PCR?buffer以及50ng正向引物和50ng反向引物，補(bǔ)充水至25μl。