[發明專利]抗逆楊樹的分子標記、篩選方法、試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201310298867.5
• 申請日: 2013-07-16
• 公開（公告）號: CN104293775A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 張德強;次東;宋躍朋;田敏;周大凌
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 吳貴明;張永明

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體而言，涉及一種篩選抗逆楊樹的分子標記、篩選方法、試劑盒及應用。?

背景技術

DNA甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一，是基因組DNA在轉錄水平上進行調控的一種修飾方式，它參與了基因表達、生物的生長發育和逆境響應應答等過程，其中，在基因表達調控中具有重要作用。對基因組甲基化進行研究最常用的技術是甲基敏感擴增多態性技術（Methylation?sensitive?amplified?polymorphism，MSAP），該方法是利用識別5‘-CCGG序列的同裂酶HpaⅡ和MspⅠ對基因組DNA甲基化敏感性不同，相同序列可以擴增出不同的譜帶，來檢測甲基化水平以及有效區分出基因組DNA的甲基化狀態。?

楊樹是我國北方的主要造林樹種。但隨著全球氣候變暖，極端天氣頻發，嚴重影響楊樹的生長與發育，進而影響林木生產的可持續發展。其中，小葉楊是楊樹屬植物中具典型抗逆特征的樹種，是設施困難立地造林的主要樹種。而且，利用傳統育種選擇抗逆性好的楊樹費時而且難度大、成本高。因此，以小葉楊為材料對研究影響楊樹抗逆性狀的分子調控機制尤為重要，而近年來對楊樹分子生物學方面的研究大多集中在群體遺傳結構與遺傳多樣性等方面，與其適應性密切相關的DNA甲基化表觀遺傳變異尚未見報道。?

目前，亟需開發有效的與楊樹抗逆相關的分子標記。?

發明內容

本發明旨在提供一種篩選抗逆楊樹的分子標記、篩選方法、試劑盒及應用，以解決現有技術中利用傳統育種選擇抗逆性好的楊樹費時而且難度大、成本高的技術問題。?

為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種篩選抗逆楊樹的分子標記。該分子標記為采用MSAP法檢測的分子標記，分子標記包括堿基序列為SEQ?ID?NO.1的MS1，SEQ?ID?NO.2的MS2，SEQ?ID?NO.3的MS3，SEQ?ID?NO.4的MS4，SEQ?ID?NO.5的MS5，SEQ?ID?NO.6的MS6，SEQ?ID?NO.7的MS7，SEQ?ID?NO.8的MS8，SEQ?ID?NO.9的MS9，SEQ?ID?NO.10的MS10。?

進一步地，待篩選楊樹中能夠檢測到上述分子標記的植株的抗逆性強于檢測不到上述分子標記的植株。。?

根據本發明的另一個方面，提供一種篩選抗逆楊樹的方法。該方法包括以下步驟：S1，提取待篩選毛白楊的基因組DNA；S2，采用MSAP法測定待篩選毛白楊的基因組DNA中是?否含有堿基序列為SEQ?ID?NO.1的MS1，SEQ?ID?NO.2的MS2，SEQ?ID?NO.3的MS3，SEQ?ID?NO.4的MS4，SEQ?ID?NO.5的MS5，SEQ?ID?NO.6的MS6，SEQ?ID?NO.7的MS7，SEQ?ID?NO.8的MS8，SEQ?ID?NO.9的MS9，SEQ?ID?NO.10的MS10的分子標記；S3，根據步驟S2中的測定結果判斷待篩選毛白楊的抗逆性。?

進一步地，待篩選楊樹中能夠檢測到分子標記的植株的抗逆性強于檢測不到分子標記的植株。?

進一步地，MSAP法所用的EcoRI接頭的序列為SEQ?ID?NO：11和SEQ?ID?NO：12，HpaII/MspI接頭的序列為SEQ?ID?NO：13和SEQ?ID?NO：14，EcoRI預擴增引物的序列為SEQ?ID?NO：15，HpaII/MspI預擴增引物的序列為SEQ?ID?NO：16，篩選引物序列為SEQ?ID?NO：17～20。?

進一步地，S2中進行MSAP法測定時的雙酶切連接反應體系的總體積為20μl，包括基因組DNA200ng，Hpa?II/Msp?I7.5U，EcoR?I7.5U，10×緩沖液2μl，50pmol的HpaII/MspI接頭和5pmol?EcoR?I接頭，T4DNA連接酶2.5U，加ddH₂O至20μl，37℃保溫12h。?

根據本發明的再一個方面，提供一種篩選抗逆楊樹的試劑盒。該試劑盒包括采用MSAP法檢測權利要求1中所述的分子標記時的EcoRI接頭的序列為SEQ?ID?NO：11和SEQ?ID?NO：12，HpaII/MspI接頭的序列為SEQ?ID?NO：13和SEQ?ID?NO：14，EcoRI預擴增引物的序列為SEQ?ID?NO：15，HpaII/MspI預擴增引物的序列為SEQ?ID?NO：16，篩選引物序列為SEQ?ID?NO：17～20。?