[發(fā)明專利]一種枯草芽孢桿菌C3及其抗單增李斯特菌細(xì)菌素的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310298551.6
• 申請日: 2013-07-17
• 公開（公告）號: CN103320370A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝遠(yuǎn)紅;劉慧;張紅星;楊永青;熊利霞;高秀芝;馬曉丹
• 申請（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)學(xué)院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C07K14/32;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/18;C12R1/125
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域中一種枯草芽孢桿菌C3及其抗單增李斯特菌細(xì)菌素的制備方法。該細(xì)菌素作為天然防腐劑適用于低溫肉與肉制品、果蔬保鮮，可提高食品的安全性。

背景技術(shù)

食品在加工、貯藏、運(yùn)輸?shù)冗^程中，易受到有害微生物的污染而導(dǎo)致腐敗變質(zhì)或?qū)е率澄镏卸荆捎锰砑臃栏瘎┑姆椒ㄒ种莆⑸锏纳L，逐漸成為食品保鮮的重要手段。傳統(tǒng)肉制品大多通過化學(xué)防腐劑保鮮，具有一定的安全隱患，使用不當(dāng)會有一定副作用，長期過量攝入對消費者的身體造成一定損害，并導(dǎo)致環(huán)境污染。因此，研發(fā)高效、安全、環(huán)境友好的天然肉制品防腐劑是食品安全的迫切需要。細(xì)菌素是指某些細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體合成的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽。Nisin是迄今研究最廣泛的細(xì)菌素，但因堿性和熱穩(wěn)定性差，限制了其在食品中的應(yīng)用。本項目已篩選出一株對單增李斯特菌有明顯抑制效果的枯草芽孢桿菌C3，該菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素對熱和pH有良好的穩(wěn)定性，并可被蛋白酶K降解，用作食品防腐保鮮劑具有較高安全性和穩(wěn)定性，具備較好的開發(fā)應(yīng)用前景。因此，建立一種高效、穩(wěn)定枯草芽孢桿菌C3細(xì)菌素的制備方法非常重要。細(xì)菌素制備方法主要有硫酸銨沉淀、離子交換層析、凝膠層析、高效液相色譜等。

細(xì)菌素在食品中的應(yīng)用通常采取以下三種方式：(1)將純化后的細(xì)菌素作為生物防腐劑直接添加到食品中；(2)將細(xì)菌素產(chǎn)生菌作為發(fā)酵劑生產(chǎn)發(fā)酵食品，可以有效防止發(fā)酵過程中雜菌污染；(3)在制備食品包裝材料的原料中添加細(xì)菌素，開發(fā)具有抑菌效果的食品包裝袋、保鮮膜等。

目前有關(guān)枯草芽孢桿菌細(xì)菌素制備方法的專利報道，如“一種枯草芽孢桿菌的胞外抗菌蛋白質(zhì)及其分離純化方法”，專利號為：200610097847.1；“枯草芽孢桿菌LFB112、其產(chǎn)生的細(xì)菌素及應(yīng)用”，申請?zhí)枮椋?01010560828.4；“枯草芽孢桿菌抗菌胞外產(chǎn)物的制備”，申請?zhí)枮椋?01010577733.3；“一株枯草芽孢桿菌及其在真菌病害防治中的應(yīng)用”，申請?zhí)枮椋?01110093415.4。目前國內(nèi)發(fā)明專利及文獻(xiàn)中關(guān)于抗單增李斯特菌的枯草芽孢桿菌細(xì)菌素的制備方法尚未見相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的是提供一株具有抗單增李斯特菌活性的枯草芽孢桿菌C3。

本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌是：枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)C3，已于2013年7月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為：CGMCC?No.9713。

枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)C3，分離篩選自北京農(nóng)學(xué)院果園土壤。

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)C3的菌落大小為3～5mm，灰白色、不透明、表面干燥、邊緣不整齊，菌體細(xì)胞呈長桿狀，短鏈狀排列，中生芽孢，G⁺好氧菌。

為了確定枯草芽孢桿菌的抑菌特性，對其發(fā)酵上清液的抑菌性能進(jìn)行了測定。測試菌株：單核細(xì)胞增生李斯特菌(簡稱單增李斯特菌)、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、黑曲霉、白邊青霉等。試驗結(jié)果表明枯草芽孢桿菌C3發(fā)酵上清液對單增李斯特菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、白邊青霉生長有抑制作用，其中對單增李斯特菌有較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌圈直徑為19.46mm。

上述方法得到的具有抗單增李斯特菌活性的枯草芽孢桿菌C3屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種具有抗單增李斯特菌活性的枯草芽孢桿菌C3細(xì)菌素制備方法。

本發(fā)明所提供的具有抗單增李斯特菌活性細(xì)菌素的提取方法是由枯草芽孢桿菌C3發(fā)酵得到的細(xì)菌素。

(1)枯草芽孢桿菌C3發(fā)酵液4℃，10000～11000r/min離心15～20min，去除菌體。

(2)采用55％～65％(W/V，質(zhì)量體積比濃度)飽和度的硫酸銨沉淀枯草芽孢桿菌C3發(fā)酵上清液，4℃靜置12h，于4℃，10000～11000r/min離心15-20min，收集沉淀物，用去離子水按發(fā)酵液1/10體積的量復(fù)溶沉淀。

(3)將復(fù)溶液分裝入預(yù)處理的透析袋中，置于去離子水中4C透析48h除鹽，透析液即為細(xì)菌素粗提液。