[發明專利]一種枯草芽孢桿菌C3及其抗單增李斯特菌細菌素的制備方法

有效

• 申請號: 201310298551.6
• 申請日: 2013-07-17
• 公開（公告）號: CN103320370A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 謝遠紅;劉慧;張紅星;楊永青;熊利霞;高秀芝;馬曉丹
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C07K14/32;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/18;C12R1/125
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1.枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)C3CGMCC?No.9713。

2.一種利用菌株C3CGMCC?No.9713為枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)的抗單增李斯特菌細菌素制備方法，其特征在于：(1)枯草芽孢桿菌C3發酵液4℃，10000～11000r/min離心15～20min，去除菌體；(2)采用55％～65％飽和度的硫酸銨沉淀枯草芽孢桿菌C3發酵上清液，4℃靜置12h；于4℃，10000～11000r/min離心15～20min，收集沉淀物，用去離子水按發酵液1/10體積的量復溶沉淀；(3)將復溶液分裝入預處理的透析袋中，置于去離子水中4℃透析48h除鹽，透析液即為細菌素粗提液；(4)細菌素粗提液用0.2μm無菌濾器過濾，采用DEAE-Sepharose?Fast?Flow陰離子交換層析法分步洗脫純化細菌素，層析柱規格為10mm×200mm；緩沖液：A液0.025mol/L?pH7.5Tric-HCl，B液含有0.4mol/L?NaCl的0.025mol/L?pH7.5Tric-HCl；分步洗脫步驟：50min?A液→90min70％A液+30％B液→40min50％A液+50％B液→40min100％B液；流速為1mL/min，上樣量5mL，自動收集器5mL/管，收集95～105min具有抑菌活性的洗脫液；(5)將有活性的收集液分裝入預處理的透析袋中，4℃去離子水中透析24h除鹽；(6)將離子交換透析液用離心真空濃縮儀在10mbar、50℃條件下濃縮，濃縮比為10∶1；(7)離子交換濃縮液經0.21μm無菌濾器過濾，采用半制備型反相液相色譜法線性梯度洗脫純化細菌素，反相制備柱型號為Agilent?ZORBAX300SB-C18，柱規格為9.4mm×250mm；流動相：A液為乙腈+0.1％三氟乙酸，B液為水+0.1％三氟乙酸；線性梯度洗脫條件：0～5min，10％～30％A液→5～10min，30％～50％A液→10～55min，50％～90％A→55～60min90％A；流速4.0mL/min，上樣量1mL，1管/min自動收集，收集19～20min具有抑菌活性的洗脫液，真空離心濃縮，去除乙腈，再將其冷凍干燥，干燥后的細菌素純品呈白色粉末狀態。