[發明專利]同時檢測雙殼類水產品中AZA1、AZA2和AZA3的方法

無效

• 申請號: 201310296478.9
• 申請日: 2013-07-15
• 公開（公告）號: CN103344722A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 孫興權;鄭秋月;李一塵;曹際娟
• 申請（專利權）人: 孫興權;鄭秋月;李一塵;曹際娟
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
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技術領域

本發明涉及一種測定雙殼類水產品中多種原多甲藻酸類貝類毒素的方法，特別涉及一種用液相色譜-串聯質譜法同時測定雙殼類水產品中三種主要原多甲藻酸類貝類毒素AZA1、AZA2和AZA3的方法。

背景技術

原多甲藻酸（Azaspiracids,AZAs）貝類毒素是一類脂溶性聚醚生物毒素，由原多甲藻(Properidininm?crassipes)產生，碳骨架由40個碳原子組成，分子中有20個立體異構中心和9個環，具有獨特的6,5,6-三螺環和環胺結構(見結構式1)，屬氨代螺旋酸類貝類毒素。AZA1在AZAs貝類毒素中最為常見，且所占比例最高，AZA2和AZA3則分別是AZA1的8-甲基和22-脫甲基衍生物，這3種貝類毒素構成了原多甲藻酸類貝類毒素的主要成分。AZAs貝類毒素毒性強且比較穩定，AZAl、AZA2和AZA3對小鼠腹腔注射致死劑量分別為200μg/kg、110μg/kg和140μg/kg，人食用含有AZAs貝類后會出現惡心、嘔吐、腹瀉、胃痙攣等癥狀。2002年3月，歐洲委員會規定雙殼類水產品中AZA1，AZA2和AZA3的最大允許濃度為160μg/kg(以貝肉計)。

小鼠生物檢測法(MBA)是以往檢測貝類毒素的常用方法，但因其存在不能判定多種毒素的具體組分，專一性、靈敏度和準確性均欠佳，重現性差等缺點，已被歐盟于2011年采用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)法取代。目前，對AZAs貝類毒素的檢測多限于AZA1，而單一的AZA1測定結果不能作為雙殼類水產品中AZAs是否超標的判斷依據，且所建檢測方法還存在著樣品處理操作繁瑣，耗時長等問題。

結構式1.原多甲藻酸類貝類毒素化學結構式

其中，AZA1:R₁=H,R₂=CH₃;AZA2:R₁=CH₃,R₂=CH₃;AZA3:R₁=H,R₂=H

發明內容

本發明針對上述技術問題，通過完善目標分析物種類，改進樣品的處理方法，提供了一種同時檢測雙殼類水產品中多種原多甲藻酸類貝類毒素的方法，該方法可同時檢測原多甲藻酸類貝類毒素中的AZA1，AZA2和AZA3三種主要成分，在提高了檢測分析效率的同時，為雙殼類水產品中AZAs貝類毒素殘留的監控及檢測提供了技術支持，也為貝類產品的品質控制和質量提高提供了可靠保證。

本發明的目的在于提供一種測定雙殼類水產品中多種原多甲藻酸類貝類毒素的方法，所述方法包括如下步驟：

提取：a向待測樣品中加入體積濃度為75～85%的甲醇水溶液，渦旋提取后，離心取上清液；b向上清液中加入正己烷，渦旋提取后，靜置分層去除正己烷層，得到提取液Ⅰ；c向提取液Ⅰ中加入氯仿，渦旋提取后，離心取下層液；d將下層液旋轉蒸發至近干后，加入甲醇和水溶解混合均勻，得提取液Ⅱ；

凈化：將提取液Ⅱ過MAX混合型陰離子交換反相吸附固相萃取小柱（MAX固相萃取小柱），以乙酸鈉水溶液-甲醇的混合液為淋洗液進行洗滌后，以體積比為98:2的甲醇:甲酸混合液為洗脫液進行洗脫，收集洗脫后的溶液，加甲醇定容，混合均勻后，過濾膜，待檢測；

檢測：采用液相色譜-串聯質譜儀進行檢測。

本發明的技術方案中，將雙殼類水產品中的殼內可食部分組織取出，清洗后，在9500r/min下均質5min，得到待測樣品。

本發明的技術方案中，步驟a中，甲醇水溶液與待測樣品的體積-質量比為4mL:1g，渦旋提取2min，重復提取2次后，在4℃以下離心5min。

本發明的技術方案中，步驟b中，按正己烷與甲醇水溶液的體積比為2-3:8加入正己烷后，在1500r/min的條件下渦旋提取1min。

本發明的技術方案中，步驟c中，按氯仿與甲醇水溶液的體積比為7-8:8加入氯仿后，在1500r/min渦旋提取2min，4℃下以8000r/min離心2min。

本發明的技術方案中，MAX固相萃取小柱使用前，依次用等體積的甲醇和水進行預洗。

本發明的技術方案中，所述淋洗液中，乙酸鈉水溶液：甲醇按體積比為95:5混合，其中，乙酸鈉水溶液的濃度為50mmol/L。

本發明的技術方案中，所述液相色譜-串聯質譜儀的檢測條件為：