[發(fā)明專利]牛布魯氏菌間接ELISA檢測試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310296209.2
• 申請(qǐng)日: 2013-07-15
• 公開（公告）號(hào): CN103344770A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊宏軍;張亮;丁家波;孫濤;張劍;何洪彬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 彭成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種牛布魯氏菌間接ELISA檢測試劑盒，屬于生物技術(shù)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人獸共患的傳染病，在全世界范圍內(nèi)呈明顯流行趨勢，對(duì)人類健康和公共衛(wèi)生構(gòu)成了巨大的威脅和損害。相關(guān)研究表明，布魯氏菌毒力基因Virb8蛋白是布魯氏菌感染的早期特異性蛋白，位于布魯氏菌細(xì)胞膜外，可引起機(jī)體早期的體液免疫反應(yīng)。

在布病檢測的實(shí)際操作中，傳統(tǒng)的虎紅平板凝集試驗(yàn)，試管凝集試驗(yàn)操作要求比較嚴(yán)格，靈敏度也比較低，而ELISA方法具有快速定性和定量、靈敏度高、適用范圍廣、結(jié)果判定客觀、成本低和可同時(shí)進(jìn)行數(shù)千份樣品的檢測等優(yōu)點(diǎn)。雖然,已有針對(duì)平滑型布魯氏菌脂多糖建立起來的競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒（公開號(hào)為CN101592661A的中國發(fā)明專利申請(qǐng)），但該方法基于脂多糖，抗體產(chǎn)生后存在時(shí)間較短，而且競爭ELISA在診斷中僅能夠?qū)κ欠窀腥静剪斒暇M(jìn)行定性判斷。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明公開了一種牛布魯氏菌間接ELISA檢測試劑盒，可用于牛布魯氏菌的批量、快速血清學(xué)檢測，具有高特異性、高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作方法簡單等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種牛布魯氏菌間接ELISA檢測試劑盒，由以下試劑構(gòu)成：

（1）預(yù)包被ELISA反應(yīng)板：數(shù)量為5塊，處理方法為：取100μl用包被液稀釋至工作濃度的包被抗原加入ELISA板的反應(yīng)孔中，4℃過夜包被后，用110μl封閉液37℃封閉2小時(shí)；包被液中，Na₂CO₃的濃度為1.59g/L，2.93g?NaHCO₃的濃度為2.93g/L，制備方法為：將1.59g?Na₂CO₃和2.93g?NaHCO₃加水充分溶解后，將pH調(diào)到9.6后（用1M的氫氧化鈉溶液調(diào)整），加去離子水定容為1L，即得；包被抗原為Virb8蛋白，工作濃度為1.16μg/mL，工作條件為4℃包被過夜；封閉液為10%馬血清（體積分?jǐn)?shù)）；

（2）25倍PBST洗滌液：體積為60ml，同時(shí)也作為樣品稀釋液；體積為1L的25倍PBST洗滌液制備方法為：將準(zhǔn)確稱量的200g?NaCl、5.0g?KCl、35.5g?Na₂HPO₄和6.75g?KH₂PO₄充分溶解在800mL去離子水中，然后將pH值調(diào)節(jié)到7.4（通過滴加1M鹽酸的方式調(diào)pH），然后加去離子水定容至1L，再加入500μL?Tween-20，即得；

（3）酶標(biāo)二抗：體積為60μl，辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記兔抗牛IgG，工作濃度為1:1000，已根據(jù)原濃度做1:12稀釋；工作條件為：37℃孵育60min；

（4）終止液：體積為60ml，2mol/L的硫酸溶液；制備方法為：10.87mL的濃硫酸與89.13mL的去離子水混合，配制成2M的H₂SO₄溶液；

（5）顯色液：體積為60ml的TMB顯色液。

所述（1）中包被抗原的制備方法為：

從牛布魯氏菌S2弱毒疫苗（購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，商品名稱為S2疫苗）中提取菌體DNA作為模板，利用設(shè)計(jì)合成的特異性引物（見實(shí)施例2），對(duì)布魯氏菌進(jìn)行Ⅳ型分泌系統(tǒng)Virb8基因的PCR擴(kuò)增，并將目的基因回收連接到T載體轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌；測序鑒定后，將Virb8基因連接到pET-32a(+)質(zhì)粒（該質(zhì)粒為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)質(zhì)粒）中，經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)后采用SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；親和層析法分離純化目的蛋白（布魯氏菌Virb8蛋白），通過Western-blotting對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定,用紫外分光光度計(jì)測定純化后的蛋白濃度。

利用上述牛布魯氏菌間接ELISA檢測試劑盒檢測的方法如下：

（1）洗滌液與樣品稀釋液的準(zhǔn)備：將25倍濃縮洗滌液用蒸餾水作25倍稀釋后備用；