[發明專利]牛布魯氏菌間接ELISA檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310296209.2
• 申請日: 2013-07-15
• 公開（公告）號: CN103344770A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 楊宏軍;張亮;丁家波;孫濤;張劍;何洪彬
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院奶牛研究中心
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 彭成

1.一種牛布魯氏菌間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于：由以下試劑構成：

（1）預包被ELISA反應板：數量為5塊，由包被液、包被抗原和封閉液構成，其中，包被液中，Na₂CO₃的濃度為1.59g/L，2.93g?NaHCO₃的濃度為2.93g/L；包被抗原為Virb8蛋白，工作濃度為1.16μg/mL，工作條件為4℃包被過夜；封閉液為10%馬血清；

（2）25倍PBST洗滌液：體積為60ml，體積為1L的25倍PBST洗滌液制備方法為：將準確稱量的200g?NaCl、5.0g?KCl、35.5g?Na₂HPO₄和6.75g?KH₂PO₄充分溶解在800mL去離子水中，然后將pH值調節到7.4，然后加去離子水定容至1L，再加入500μL?Tween-20，即得；

（3）酶標二抗：體積為60μl，辣根過氧化物酶HRP標記兔抗牛IgG，工作濃度為1:1000，工作條件為：37℃孵育60min；

（4）終止液：體積為60ml，2mol/L的硫酸溶液；

（5）顯色液：體積為60ml的TMB顯色液。

2.根據權利要求1所述的一種牛布魯氏菌間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于：所述（1）中，預包被ELISA反應板的處理方法為：取100μl用包被液稀釋至工作濃度的包被抗原加入ELISA板的反應孔中，4℃過夜包被后，用110μl封閉液37℃封閉2小時。

3.根據權利要求1所述的一種牛布魯氏菌間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于：所述（1）中，包被液的制備方法為：將1.59g?Na₂CO₃和2.93g?NaHCO₃加水充分溶解后，將pH調到9.6后，加去離子水定容為1L，即得。

4.根據權利要求1所述的一種牛布魯氏菌間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于：所述（1）中，包被抗原的制備方法為：

從牛布魯氏菌S2弱毒疫苗中提取菌體DNA作為模板，利用設計合成的特異性引物，對布魯氏菌進行Ⅳ型分泌系統Virb8基因的PCR擴增，并將目的基因回收連接到T載體轉化DH5α大腸桿菌；測序鑒定后，將Virb8基因連接到pET-32a(+)質粒中，經鑒定后轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，IPTG誘導后采用SDS-PAGE分析蛋白質的表達情況；親和層析法分離純化目的蛋白。

5.根據權利要求4所述的一種牛布魯氏菌間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于：所述特異性引物如下：

上游引物??5’—GGATCCATGTTTGGACGCAAACAATCTCC—3’；

下游引物??5’—AAGCTTTCATTGCACCACTCCCATTTCTGG—3’，如序列表中序列1、2所示。

6.利用權利要求1～5中任一項所述的一種牛布魯氏菌間接ELISA檢測試劑盒檢測的方法，其特征在于：步驟如下：

（1）洗滌液與樣品稀釋液的準備：將25倍濃縮洗滌液用蒸餾水作25倍稀釋后備用；

（2）加樣：分別設空白孔、標準陽性孔和標準陰性孔以及待測樣品孔；將標準陽性血清、標準陰性血清和樣品血清按1:1500稀釋后，在酶標包被板的反應孔內準確加樣100μl，空白孔直接加100μl樣品稀釋液；

（3）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育1小時；

（4）洗滌：揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加300μl洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干；

（5）酶標二抗的稀釋：用PBST將酶標二抗按1:1000稀釋后備用；

（6）加入二抗：每孔加入100μl稀釋好的酶標二抗，空白孔除外；

（7）溫育：操作同（3）；

（8）洗滌：操作同5；

（9）顯色：每孔先加入100μl?TMB顯色劑，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘；

（10）終止：每孔加100μl終止液，終止反應；

（11）測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度；測定在加終止液后15分鐘以內進行；

結果判定：標準陽性血清OD_450nm值大于1.0，標準陰性血清OD450nm值小于0.30時，實驗結果判定為合格；反之，為不合格，需要重新檢測；待測樣品的OD450nm值大于0.39時為陽性，小于或等于0.39時為陰性。