[發明專利]一種用于高效生產海藻糖的基因工程菌

有效

• 申請號: 201310296116.X
• 申請日: 2013-07-15
• 公開（公告）號: CN103468624A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 陶榮盛;原犇犇;朱傅赟;沈青;楊晟;蔣宇
• 申請（專利權）人: 上海工業生物技術研發中心;中國科學院上海生命科學研究院湖州工業生物技術中心
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P19/24;C12P19/14;C12P19/12;C12R1/19
• 代理公司: 上海華工專利事務所 31104
• 代理人: 應云平

技術領域

本發明屬于基因工程和酶催化領域，具體涉及一種用于高效生產海藻糖的基因工程菌以及利用該工程菌高效生產海藻糖的方法。?

背景技術

海藻糖是由2個吡喃葡萄糖以α,α-1,1-糖苷鍵連接而成的非還原性雙糖，廣泛存在于自然界的動植物和微生物中，但含量很低。海藻糖無色無嗅，具有很強的熱穩定性、酸穩定性和化學穩定性，對蛋白質、核酸、細胞膜等具有很強的穩定作用，通常在環境脅迫條件下大量產生，對生物大分子乃至生物體起保護作用。海藻糖是一種有效的保護劑，可以保護酶、蛋白、生物膜、生物醫藥制劑甚至待移植的器官，也可被開發成高級化妝品，在食品工業上常用作新型甜味劑、保濕劑和脫水劑，有著廣泛的應用前景。?

目前，海藻糖的生產方法主要有微生物細胞抽提法、基因工程菌發酵法、酶轉化法，其中，酶轉化法因其成本低廉、工藝簡單而具有廣闊的應用前景。特別是利用麥芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase）和麥芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase）以及海藻糖合成酶（Trehalose?synthase）以淀粉、淀粉水解物、麥芽低聚糖、麥芽糖等為底物酶法轉化生產海藻糖現已成為海藻糖工業化生產的主要方法。?

KR20000037638、US5773282、CN101100658A、CN1563372A等專利公布了一些采用海藻糖合成酶生產海藻糖的方法。然而，海藻糖合成酶需要以麥芽糖為底物生產海藻糖，因此需要先制得含量較高的麥芽糖漿，麥芽糖漿中的麥芽糖部分被轉化為海藻糖，所以從淀粉到海藻糖總的轉化率不高，并且制備高麥芽糖漿的成本相對較高。?

聯合使用麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶生產海藻?糖的雙酶法路線更具有優勢，只需要將淀粉進行簡單的液化和去支化，然后，在麥芽寡糖基海藻糖合成酶的作用下，淀粉及其部分水解物還原性末端形成具有海藻糖結構的非還原性末端，再經麥芽寡糖基海藻糖水解酶作用，將該海藻糖末端切下生成海藻糖，此過程重復進行，從而得到較高海藻糖產率。US2007087426A1、US5472863A、CN1504567A等專利公開了一些可以產生麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶的微生物，使用這些酶可以生產海藻糖。?

Tetsuya?Nakada等（Purification?and?characterization?of?a?novel?enzyme,maltooligosyl?trehalose?trehalohydrolase,from?Arthrobacter?sp.Q36.Bioscience,Biotechnology,and?Biochemistry,1995,59(12):2215-2218）對來自節桿菌的MTSase和MTHase進行了研究，以10%淀粉溶液為原料，雙酶的加量分別為2.5U?MTSase/g淀粉、10U?MTHase/g淀粉，經72h轉化，海藻糖產率為75%。US5472863A中所述菌株發酵周期長達72小時以上，MTSase和MTHase的發酵酶活分別為1.3U/mL和1.8U/mL；US2007087426A1采用大腸桿菌基因工程菌分別表達兩個酶，該雙酶以20%可溶性淀粉水溶液為原料，經過100～120小時的轉化，海藻糖產率不到80%；Masaru?Kato（Trehalose?production?with?a?new?enzymatic?system?from?Sulfolobus?solfataricus?KM1.Journal?of?Molecular?Catalysis?B:Enzymatic,1999,6(3):223-233）研究中采用與US2007087426A1所述相同的兩個酶，原料為10～25%淀粉濃度，酶加量分別為30U?MTSase/g淀粉和30U?MTHase/g淀粉，最終獲得78.6～81.5%的轉化率。在當淀粉濃度達到20%以上時，海藻糖轉化率最高不到80%，并且這個來源的麥芽寡糖基海藻糖水解酶具有較強的淀粉酶活性，容易造成原料的損失。CN1504567A也是采用大腸桿菌基因工程菌分別表達這兩個酶，發酵酶活分別為：MTSase60U/mL發酵液，MTHase250U/mL發酵液，在30%淀粉濃度、2U?MTSase/g淀粉、10U?MTHase/g淀粉的條件下，轉化周期長達64小時，經分離純化后，海藻糖收率只有50%。?