[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)P24抗原的碳量子點(diǎn)試紙條的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310295487.6
• 申請(qǐng)日: 2013-07-15
• 公開（公告）號(hào): CN103344756A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡敏;潘藝;梁好
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N33/558
• 分類號(hào): G01N33/558
• 代理公司: 廣州凱東知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44259
• 代理人: 姚迎新

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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于檢測(cè)P24抗原的試紙條，具體說是一種用于檢測(cè)P24抗原的試紙條的制備方法。

背景技術(shù)

機(jī)體感染艾滋病HIV病毒后，P24抗原是較早能從血清中檢出的病原學(xué)標(biāo)志，感染后2—3周即可檢出。目前檢測(cè)P24抗體一般采用試紙條，試紙條主要是在底板上依次粘結(jié)樣品墊、膠體金墊、包被膜和吸水墊。其中樣品墊的處理是將玻璃纖維膜放入含有BSA和PBS樣品墊處理溶液中處理；包被膜的制備是用包被膜緩沖液稀釋抗原后噴印在包被膜上；膠體金墊的制備是用碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金溶液，并將該溶液與其他抗原進(jìn)行重組，混勻重組抗原后靜置，離心處理，棄去上清，將沉淀用標(biāo)記洗滌液洗滌，再將沉淀用膠體金的金標(biāo)抗原保存液溶解，最后將溶解液涂覆在玻璃纖維膜上，干燥后保存，從而制得膠體金墊。這種形式的試紙條由于含有膠體金墊，其不僅靈敏度較低，而且膠體金的原材料中含氯金酸，具有毒性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于提供一種用于檢測(cè)P24抗原的碳量子點(diǎn)試紙條的制備方法，通過該方法制備的試紙條不僅靈敏度較高，而且很少或無毒性。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案為：一種用于檢測(cè)P24抗原的碳量子點(diǎn)試紙條的制備方法，包括在底板兩端分別粘結(jié)樣品墊和吸水墊的步驟，還包括以下步驟：

（1）P24碳量子點(diǎn)墊的制取和P24硝酸纖維素膜的制備；

（2）在所述底板上依次相互搭接地粘結(jié)所述樣品墊、P24碳量子點(diǎn)墊、P24硝酸纖維素膜和吸水墊，得到試紙板；

（3）將試紙板切割成若干條符合規(guī)定寬度的試紙條，并將試紙條密封保存。

作為優(yōu)選，上述（1）中的P24碳量子點(diǎn)墊的制取按以下步驟進(jìn)行：

1）制備、純化碳量子點(diǎn)溶液：

a、用三口搖瓶收集碳灰與硝酸溶液，并混勻；

b、將上述混勻的溶液在100℃磁力攪拌下回流12h，再以3000rpm?、4℃離心10?min，分離未反應(yīng)的碳灰；

c、收集上述溶液中清亮的棕黃色上清液，棄去沉淀；

d、加入3倍上述上清液體積的丙酮溶液，以14000rpm離心10?min，棄去上清液，收集沉淀；

e、將上述收集的沉淀干燥后，溶于去離子水中，用碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。

f、將上述去離子水溶液于4℃、12000rpm離心30min，收集上清液；

g、將上述收集的上清液加入到透析袋中透析48h，去除雜質(zhì)，得到純化的水溶性碳量子點(diǎn)溶液。

2）利用上述碳量子點(diǎn)溶液制取P24碳量子點(diǎn)偶聯(lián)抗體：

h、將P24抗體加入EDC和NHS混合溶液中，室溫反應(yīng)30min；

i、向上述混合溶液中加入巰基乙醇，淬滅未反應(yīng)的EDC；

j、加入等體積的上述純化的水溶性碳量子點(diǎn)溶液，室溫下反應(yīng)2h；

k、加入BSA溶液與NH4Cl溶液，室溫放置10min；

n、用PBS透析除去未偶聯(lián)的抗體及游離NHS，得到P24碳量子點(diǎn)偶聯(lián)抗體。

3）將玻璃纖維膜放入含有蔗糖、BSA、吐溫的磷酸緩沖液中浸透，取出干燥后放入上述制取的P24碳量子點(diǎn)偶聯(lián)抗體中浸泡10?min，再取出晾干，得到P24碳量子點(diǎn)墊；

4）待上述P24碳量子點(diǎn)墊干燥后，4℃保存。

作為優(yōu)選，上述（1）中P24硝酸纖維素膜制備是在硝酸纖維素膜上均勻地噴上分別針對(duì)Test區(qū)和Control區(qū)的P24抗體和羊抗鼠IgG，室溫下干燥后用適當(dāng)濃度的BSA溶液進(jìn)行封閉，然后用Na2HPO4洗滌液漂洗三次，室溫下充分干燥后，4℃保存。

從以上方案可知，本發(fā)明制備的碳量子點(diǎn)試紙條是一種以膜為固相載體的快速診斷技術(shù)，是將已知的特異性抗體或抗原先固定于纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)待測(cè)樣品加到樣本墊上后，由于毛細(xì)管虹吸作用，待測(cè)樣品將沿著膜從一端向另一端移動(dòng)，從而溶解碳量子點(diǎn)墊上的碳量子點(diǎn)標(biāo)記試劑，并與之相互反應(yīng)；當(dāng)移至固有已知抗體或抗原的區(qū)域時(shí)，該已知的抗體或抗原會(huì)與待測(cè)樣品，即碳量子點(diǎn)標(biāo)記試劑的結(jié)合物發(fā)生特異性結(jié)合，使大量的碳量子點(diǎn)聚集在檢測(cè)帶上，當(dāng)大量的免疫碳量子點(diǎn)聚集時(shí)可使該區(qū)域在紫外燈下發(fā)出明亮的光，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。因此，根據(jù)本方法獲得試紙條由于采用了碳量子點(diǎn)，其在檢測(cè)時(shí)不僅靈敏度較高，而且少毒性或無毒性。

附圖說明

圖1是從左到右依次為檢測(cè)P24標(biāo)準(zhǔn)品抗原1000?pg/ml?,100pg/ml,10pg/ml?,1?pg/ml?,?0.1pg/ml；