[發明專利]一種克隆山羊IGFBP2基因編碼區全序列的方法

無效

• 申請號: 201310295286.6
• 申請日: 2013-07-15
• 公開（公告）號: CN104293767A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 占思遠;張紅平;李利;仲濤;王林杰
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及動物基因工程技術領域，更具體地說涉及一種從山羊肝臟組織中克隆IGFBP2（Insulin-like?growth?factor?binding?protein?2）基因編碼區全序列的方法。?

背景技術

畜禽的生長發育受到神經內分泌生長軸的調控，對于哺乳動物而言，主要依賴下丘腦-垂體-靶器官通路來完成。而胰島素樣生長因子結合蛋白（IGFBPs）和胰島素樣生長因子（IGFs）之間作為其中的一個生長調控軸，對于調控動物的生長和發育具有重要的作用和意義。IGFBPs跟IGFs的結合能夠正向或負向調節IGFs的生物活性從而實現其生物功能。IGFBPs調節IGFs的生物學功能主要表現在：（1）在血液中作為轉運蛋白運輸IGFs；（2）延長IGFs的半衰期并調控它們的代謝清除率；（3）運輸IGFs到特定的組織和細胞發揮作用；（4）通過調節IGFs與其受體間的相互作用，影響IGFs的生物學活性。體內循環的IGFBPs可以和IGFs形成二聚復合物，通過毛細血管內皮，將IGFs轉運至靶組織，通過第二信使發揮IGFs的促合成代謝作用，從而達到促進動物生長的作用。由此可見，IGFBPs在動物的生長發育過程中起到至關重要的作用。?

RT-PCR克隆：是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式反應以及分子克隆相結合的一種技術。首先利用反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板，擴增我們需要的目的基因片段，然后將此片段與載體連接轉化到感受態細胞中進行克隆，獲得的質粒PCR產物進行測序。此技術利用PCR?技術能在體外進行有效的基因擴增，而不需要內切酶消化和連接酶處理，能夠快速獲得其它依靠限制性內切酶消化法難于得到的PCR產物；同時該方法能克服普通PCR產物測序引物近端的十幾個堿基無法測序獲得的缺點。與RACE(cDNA末端快速擴增)?技術相比較而言，目的基因片段的長度明確，成本較低，工作量小。該技術的關鍵是PCR引物的設計，在起始密碼子的上游設計正向引物，在終止密碼子的下游設計反向引物，使得PCR產物能包含完整的基因編碼區全序列。?

獲得目的基因編碼區序列一般采用克隆或RACE技術，RACE技術是基于PCR技術基礎上由已知的一段cDNA片段，通過向兩端延伸擴增從而獲得完整的3’端和5’端。但該技術與克隆技術相比，目的基因片段的長度不明確，試驗成本高，工作量大，對于提取的RNA質量要求較高，因此應用相對較少。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種簡單、快速獲取山羊IGFBP2基因完整編碼區序列的方法，填補在山羊上該基因研究的空白，為進一步研究其在山羊上的功能奠定基礎。?

本發明采用以下技術方案：?

一種克隆山羊IGFBP2基因編碼區全序列的方法，包括以下步驟：

A1、從山羊肝臟組織樣品中提取總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA；

A2：以綿羊該基因的序列為模板在起始密碼子上游區域和終止密碼子的下游區域設計引物；

A3：以cDNA為模板進行PCR擴增；

A4：擴增產物的膠回收和純化；

A5：純化的產物進行克隆與測序，即能得到山羊IGFBP2基因的編碼區全序列。

所述的方法，步驟A1包括以下步驟：取用液氮研磨好的組織粉末約80mg，加入預先盛有1mL?Trizol的EP管中，振蕩混勻后，室溫靜置5min；加氯仿0.2mL(必須按總體積的1/5)，旋渦儀振蕩混勻15秒，室溫靜置5min；4℃下12000rpm離心15min；轉移上層水相450μL于另一個新的1.5mLEP管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10min；4℃下12000rpm離心10min；棄去上層清液后，加入4℃預冷的75%乙醇（用DEPC處理水配制）1mL，靜置5min，4℃下7500g離心5min；棄上清，用槍吸取多余的液體，空氣干燥約3min；加入30μL?DEPC處理水，吹打混勻，充分溶解RNA，然后立即反轉錄成cDNA。?

所述的方法，步驟A2中引物為SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4。?

附圖說明

序列表SEQ?ID?NO:1，山羊IGFBP2基因核苷酸序列。?

序列表SEQ?ID?NO:2，山羊IGFBP2基因編碼的氨基酸序列。?

圖1是山羊IGFBP2基因的PCR產物電泳圖。?

圖2是山羊IGFBP2基因編碼區的核苷酸序列和預測的氨基酸序列。?

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。?

具體實施步驟：?