[發(fā)明專利]一種螢火蟲熒光素酶及其編碼基因及獲取方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310293868.0
• 申請日: 2013-07-12
• 公開（公告）號: CN103409380A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃鶴;于浩然;王玥;肖天雄
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 王麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子酶學(xué)與生物技術(shù)，更具體涉及一種高熱穩(wěn)定性高活性螢火蟲熒光素酶的編碼基因以及該酶的獲取方法。

背景技術(shù)

在鎂離子,ATP,分子氧的存在下螢火蟲熒光素酶催化底物蟲熒光素的氧化同時發(fā)出熒光。這個反應(yīng)具有極高的效率。目前螢火蟲熒光素酶已經(jīng)作為研究領(lǐng)域的新工具出現(xiàn)在市場上，它具有非放射性、反應(yīng)靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確、應(yīng)用范圍廣、操作簡單、無毒副作用等多種優(yōu)點，因此非常適合應(yīng)用于分子生物學(xué)、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、刑偵、藥理學(xué)、微生物檢測等各個領(lǐng)域。例如在醫(yī)療中，它可被用于癌癥轉(zhuǎn)移的研究和檢測抗癌療法的療效，在刑偵上可以用來檢測血跡，而其中具有最廣闊市場前景的便是熒光素酶在環(huán)境微生物檢測方面上的運用。在過去的十年里，ATP熒光快速檢測法已經(jīng)變成一種國際測定物體表面清潔水平的標(biāo)準(zhǔn)方法。

蟲熒光素酶可以從螢火蟲體內(nèi)直接獲取。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來通過基因工程技術(shù)制備蟲熒光素酶的方法也已經(jīng)成熟。1985年，De?Wet等首次克隆了北美螢火蟲(P.Pyralis)熒光素酶的基因，并成功利用大腸桿菌表達(dá)制備了蟲熒光素酶。國內(nèi)方面，林金明等人于2008年獲得了含有蟲熒光素酶基因表達(dá)載體的重組細(xì)胞，培養(yǎng)該細(xì)胞，成功獲得具有生物活性的蟲熒光素酶，實現(xiàn)了蟲熒光素酶生產(chǎn)的國產(chǎn)化。

然而，野生型和重組型的熒光素酶很不穩(wěn)定，當(dāng)它們暴露于30℃，尤其是35℃以上時會迅速失去活性。這樣的熱穩(wěn)定性不能滿足該酶在高溫下的使用及保存，或通過加熱提高反應(yīng)速度。目前有很多針對提高螢火蟲熒光素酶(luciferase)穩(wěn)定性方面的改造。例如，Peter?J?Whiter等人在北美螢火蟲(P.Pyralis)熒光素酶引入的兩個突變點E354K，A215L已經(jīng)被證明有效的提高了蟲熒光素酶的熱穩(wěn)定性。另外，2010年Mehdi?Imani等人在北美螢火蟲熒光素酶(luciferase)中引入突變點A296C/A326C,同樣成功提高了其熱穩(wěn)定性并降低了其對PH的敏感度。盡管在提高蟲熒光素酶的穩(wěn)定性方面取得一定進展，但目前該方面研究主要集中于西方國家。隨著螢火蟲熒光素酶在國內(nèi)應(yīng)用的普遍，非常有必要生產(chǎn)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高穩(wěn)定性蟲熒光素酶。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服原有北美螢火蟲熒光素酶熱穩(wěn)定性差，尚不能滿足高溫下應(yīng)用的缺陷，對原有北美螢火蟲熒光素酶進行突變，得到熱穩(wěn)定性顯著提高的突變酶，提高其應(yīng)用價值。

本發(fā)明的另一個技術(shù)問題是提供編碼上述北美螢火蟲熒光素酶突變體的編碼基因。

本發(fā)明還有一個技術(shù)問題是提供上述北美螢火蟲熒光素酶突變體的制備方法。該方法是構(gòu)建含有野生型螢火蟲熒光素酶基因的重組表達(dá)載體，利用親和層析的方法純化該蛋白，該方法簡單易行，操作簡單，成本低廉。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

一種具有北美螢火蟲熒光素酶活性的蛋白質(zhì),其氨基酸序列為SEQ?ID?NO.1。

本發(fā)明的氨基酸序列獲得方法，步驟如下：

（1）從PDB數(shù)據(jù)庫中下載北美螢火蟲熒光素酶的PDB格式的坐標(biāo)文件1BA3，利用DeepView4.1軟件對1BA3文件進行處理：補全缺失殘基及原子，去除配體分子；

（2）利用Gromacs4.5.4對處理后文件進分子動力學(xué)模擬，計算蛋白質(zhì)每個脯氨酸的RMSF（Root?Mean?Square?Fluctuation）值；確定了具有最高靈活性的區(qū)域482-491aa；

（3）脯氨酸出現(xiàn)在I型，II型β轉(zhuǎn)角的i+1位置氨基酸及II型β轉(zhuǎn)角i位置氨基酸的概率最大；確定螢火蟲熒光素酶結(jié)構(gòu)中提高穩(wěn)定性突變位點：H489P，即將野生型螢火蟲熒光素酶氨基酸序列的第489位的組氨酸突變?yōu)楦彼帷?/p>

編碼中所述蛋白質(zhì)的基因，DNA序列為SEQ?ID?NO.2。

本發(fā)明包括所述基因的重組載體與重組菌。

本發(fā)明所述的重組載體獲取方法，通過將包含野生型Luc基因的載體進行定點突變得到，該突變是將野生型北美螢火蟲熒光素酶(P.Pyralis?luciferase)基因上的第489位的組氨酸密碼子改變成脯氨酸的密碼子。

重組載體獲取方法步驟如下：

1）含有野生型螢火蟲熒光素酶基因的重組載體的構(gòu)建：