[發明專利]一種螢火蟲熒光素酶及其編碼基因及獲取方法

有效

• 申請號: 201310293868.0
• 申請日: 2013-07-12
• 公開（公告）號: CN103409380A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 黃鶴;于浩然;王玥;肖天雄
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

1.一種具有北美螢火蟲熒光素酶活性的蛋白質,其特征是氨基酸序列為SEQ?ID?NO.1。

2.權利要求1中所述氨基酸序列獲得方法，其特征是步驟如下：

1）從PDB數據庫中下載北美螢火蟲熒光素酶的PDB格式的坐標文件1BA3，利用DeepView4.1軟件對1BA3文件進行處理：補全缺失殘基及原子，去除配體分子；

2）利用Gromacs4.5.4對處理后文件進分子動力學模擬，計算蛋白質每個脯氨酸的RMSF（Root?Mean?Square?Fluctuation）值；確定了具有最高靈活性的區域482-491aa；

3）脯氨酸出現在I型，II型β轉角的i+1位置氨基酸及II型β轉角i位置氨基酸的概率最大；確定螢火蟲熒光素酶結構中提高穩定性突變位點：H489P，即將野生型螢火蟲熒光素酶氨基酸序列的第489位的組氨酸突變為脯氨酸。

3.編碼權利要求1中所述蛋白質的基因，其特征是DNA序列為SEQ?ID?NO.2。

4.含有權利要求3中所述基因的重組載體與重組菌。

5.權利要求4所述的重組載體獲取方法，通過將包含野生型Luc基因的載體進行定點突變得到，該突變是將野生型北美螢火蟲熒光素酶(P.Pyralis?luciferase)基因上的第489位的組氨酸密碼子改變成脯氨酸的密碼子。

6.如權利要求5所述的獲取方法，其步驟如下：

1）含有野生型螢火蟲熒光素酶基因的重組載體的構建：

（1）以含有熒光素酶基因的質粒pGL2-control?vector的核苷酸序列，結合質粒pET28a的多克隆位點與熒光素酶（Luc）基因的限制性內切酶位點設計引物；引物中包含BamHⅠ和HindⅢ突變位點；

（2）以含有Luc基因的質粒pGL2-control?vector為模板，進行PCR擴增；含有Luc基因的PCR擴增產物純化后，用限制性內切酶BamHⅠ和HindIII進行雙酶切，酶切產物與用同樣酶切的載體pET28a用T4連接酶進行連接；連接產物轉化進入大腸桿菌DH5α；

（3）在固體培養基上隨機挑取幾個單菌落接種至含卡那霉素的LB液體培養基中，37℃震蕩培養12h，提取質粒；利用BamHⅠ和HindIII進行雙酶切驗證；驗證成功的克隆子進行測序驗證；

2）快速定點突變方法引入突變位點：

（1）設計引物，引物中包含使Luc基因中489位組氨酸密碼子改變為脯氨酸密碼子的突變點；

（2）以上述步驟1）獲取的含有野生型Luc基因的表達載體為模板，進行PCR擴增，擴增產物為突變型重組表達載體；該突變型重組表達載體內含有SEQ?ID?NO.2所示DNA序列。

7.權利要求4所述的重組菌，其特征在于：所述重組菌是將權利要求5中獲得的重組載體轉化進入大腸桿菌BL21（DE3）中得到。