[發明專利]一種檢測豬外周血和脾臟淋巴細胞膜表面分子的樣品制備試劑盒及其制備方法

在審

• 申請號: 201310292681.9
• 申請日: 2013-07-12
• 公開（公告）號: CN103424294A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 蘇華荔;王安如
• 申請（專利權）人: 北京大北農科技集團股份有限公司;浙江大北農農牧科技有限公司;漳州大北農農牧科技有限公司
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N15/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及豬外周血和脾臟淋巴細胞膜表面分子的流式細胞檢測技術，特別提供了適用于條件較差的基層豬場實驗室的流式細胞樣品制備方法。

背景技術

我國是豬肉生產和消費的大國。在國際上，我國生豬存欄量、屠宰量以及豬肉產量已多年占據世界首位。國家統計局數據顯示，2012年我國豬肉產量5335萬噸，同比增長5.6%。我國養殖業在世界有著舉足輕重的地位。自80年以來，中國養豬業進入了由農戶養豬向集約化和產業化轉型期，養豬科學技術也取得了長足的進步。然而，養豬業也正面臨著豬病和食品安全的極度困擾。

由于豬病流行日趨復雜化以及科學養豬理念的深入人心，越來越多的規模化豬場開始籌備建立獸醫實驗室來有效監控豬病，為豬群的保健提供技術支持。但是典型的豬場實驗室只能完成大體病理學解剖，顯微鏡檢驗，血清學檢驗和簡單的生化檢測。而多數流行性疾病的診斷，疫苗免疫效果檢測和飼用添加劑功效檢驗等尚需做細胞免疫反應相關指標的檢驗，該檢驗的常規儀器——流式細胞儀屬于高端科研型儀器，絕大多數基層實驗室都尚未配備，限制了細胞學檢驗的有效實施。

流式細胞術是一種基于熒光手段的生物學檢測技術，廣泛應用于細胞計數，分選和生物標記物檢測。主要原理是將單細胞懸液用一定壓力壓入流動室，細胞呈單行排列依次通過檢測區域，收集監測數據后對數據進行分析。外周血、骨髓穿刺物，組織活檢物等樣本等都可用流式細胞術分析。但是樣本的條件控制是待檢樣本質量控制的最關鍵環節，這對于樣本的采集、保存、運輸和制備均提出了較高的要求。如溶血、壞死的樣本均不適于流式檢測。

常規流式細胞術檢驗前，細胞樣品經過分離、染色等一系列處理后應即時或盡快上機檢驗。但是若將待檢動物或組織冷凍保存并運輸至高校或科研機構再制備細胞樣品的話，不但加重了運輸成本也使得檢測過程復雜化，費時費力。在基層實驗室先進行細胞樣品的制備，并妥善保存后運送至流式檢測平臺可為解決這一問題提供提一條很好的策略。細胞內分子檢測，可先固定細胞長期保存。但是，在染色前固定細胞的話可能會破壞膜表面蛋白分子的結構，不利于膜表面蛋白分子的檢測（如T細胞表面CD3，CD4等）。而且，基層實驗室無菌級別較低，所制備樣品保存時間過久可能誘發細菌大量增殖而導致流式檢測失敗。另外，流式染色過程中，非特異性染色或染色強度較弱都對檢測結果造成不利影響。由此可見，在豬場實驗室的簡易條件下制備高質量的細胞樣本，并可將樣本長途運輸至檢測目的地是目前豬場疾病防控管理與研發工作迫切需要解決的問題。然而目前為止，尚未見較為成熟可行的適于基層豬場流式細胞術檢測樣品制備的方法。

發明內容

為了解決上述基層豬場流式細胞術分析樣品的制備方法問題，本發明的目的是提供了一種適用于利用流式細胞術進行豬外周血和脾臟淋巴細胞膜表面抗原檢測的樣品制備方法，實現檢測樣品的長途運輸和保存，檢測結果高效而穩定。

為實現上述目的，本發明首先提供一種適用于流式細胞術檢測豬外周血和脾臟淋巴細胞膜表面分子的樣品制備試劑盒，包括緩沖液I、緩沖液II和緩沖液III，所述緩沖液I為含100-800U/ml青霉素，100-800μg/ml鏈霉素，1-8μg/ml兩性霉素B的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4；所述緩沖液II為含2mM?EDTA,0.2%-0.6%BSA，100-800U/ml青霉素，100-800μg/ml鏈霉素，1-8μg/ml兩性霉素B的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4；所述緩沖液III為含0.1%NaN₃，1%-5%多聚甲醛的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4。

在本發明一個優選的實施方案中，所述緩沖液I為含500U/ml青霉素，5μg/ml鏈霉素，5μg/ml兩性霉素B的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4；所述緩沖液II為含2mM?EDTA,0.5%BSA，500U/ml青霉素，500μg/ml鏈霉素，5μg/ml兩性霉素B的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4；所述緩沖液III為含0.1%NaN₃，2%多聚甲醛的PBS緩沖液，pH值為7.2-7.4。

進一步地，本發明的試劑盒還可優選包括紅細胞裂解液，所述紅細胞裂解液主要成分為：0.16M?NH₄Cl，0.13mM?EDTA，12mMNaHCO₃，pH值為7.2。

進一步地，本發明還提供一種利用所述的試劑盒進行豬外周血和脾臟淋巴細胞膜表面抗原流式細胞術檢測的樣品制備方法，其包括采集豬外周血和豬脾臟組織，制備淋巴細胞單細胞懸液，裂解紅細胞后用抗體染色后固定，直至用流式細胞儀進行檢測。