[發明專利]一種外源基因可移除的慢病毒受控表達載體系統及應用

無效

• 申請號: 201310292567.6
• 申請日: 2013-07-11
• 公開（公告）號: CN103352053A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發明（設計）人: 付強;楊潤林;鄧黎莉;彭瑩;丁月娣;范俊
• 申請（專利權）人: 江蘇省原子醫學研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;G01N21/64;G01N15/14
• 代理公司: 無錫華源專利事務所(普通合伙) 32228
• 代理人: 馮智文

1.一種外源基因可移除的慢病毒受控表達載體系統，該系統包括表達質粒和包裝質粒，其特征在于：所述表達質粒包括反應質粒和調節質粒，并分別通過如下方法構建獲得：

（1）反應質粒的構建

通過慢病毒載體pSMPUW3’LTR?U3區域部分堿基的定點突變引入酶切位點，將loxP序列插入所述pSMPUW3’LTR，得突變質粒；用Tet-on系統反應質粒pTRE-Tight上的順式作用元件TRE和最簡化CMV啟動子序列取代所述突變質粒的啟動子序列，并將外源性報告基因插入所述突變質粒的多克隆位點MCS位置，得反應質粒；所述外源性報告基因處于所述TRE和最簡化CMV啟動子控制之下，并由Dox誘導表達。

（2）調節質粒的構建

將Tet-on系統中的CMV-rtTA2S-M2序列、內部核糖體進入位點EMCV序列以及Cre-ER序列順序連接起來，插入步驟（1）中定點突變的pSMPUW的多克隆位點區域，得調節質粒；所述rtTA2S-M2序列和Cre-ER序列能各自獨立地進行翻譯和表達，生成rtTA2S-M2蛋白及Cre重組酶雌激素受體融合蛋白。

2.根據權利要求1所述的慢病毒受控表達載體系統，其特征在于：所述包裝質粒包括pRSV-Rev、pCMV-VSV-G、pCgpV。

3.根據權利要求1所述慢病毒受控表達載體系統，其特征在于：所述突變位點序列為ACCGGT，突變后序列為ACGCGT，引入Mlu?I酶切位點。

4.根據權利要求1所述慢病毒受控表達載體系統，其特征在于：所述外源性報告基因包括熒光蛋白、激酶、激素或細胞因子受體的表達基因。

5.根據權利要求1所述慢病毒受控表達載體系統，其特征在于：在步驟（2）中，先對步驟（1）中定點突變的pSMPUW多克隆位點區進行定點突變引入Asc?I酶切位點，以利于所述CMV-rtTA2S-M2序列、內部核糖體進入位點EMCV序列及Cre-ER序列的插入。

6.根據權利要求1所述慢病毒受控表達載體系統，其特征在于：4-OH-tamoxifen能誘導所述Cre重組酶雌激素受體融合蛋白與Hsp90解除結合，使Cre重組酶切除所述loxP序列之間的所述外源性報告基因和慢病毒載體序列。

7.權利要求1～6中任一項所述慢病毒受控表達載體系統在干細胞活體示蹤技術中的應用，其特征在于：將所述反應質粒和調節質粒分別與所述包裝質粒共轉染包裝細胞，得到反應慢病毒和調節慢病毒；將二者共轉染靶干細胞，利用Dox誘導所述外源性報告基因表達并進行顯像示蹤，最后利用4-OH-tamoxifen誘導切除所述loxP序列之間的外源性報告基因。