[發明專利]一種外源基因可移除的慢病毒受控表達載體系統及應用

無效

• 申請號: 201310292567.6
• 申請日: 2013-07-11
• 公開（公告）號: CN103352053A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發明（設計）人: 付強;楊潤林;鄧黎莉;彭瑩;丁月娣;范俊
• 申請（專利權）人: 江蘇省原子醫學研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;G01N21/64;G01N15/14
• 代理公司: 無錫華源專利事務所(普通合伙) 32228
• 代理人: 馮智文

技術領域

本發明涉及攜帶外源性報告基因的慢病毒表達載體系統，尤其涉及由強力霉素（Dox）調控表達，且攜帶的外源性報告基因可從宿主染色體移除的慢病毒受控表達載體系統，以及該系統在干細胞活體示蹤技術中的應用。屬于基因工程技術領域。

背景技術

外源性報告基因的過表達需要一個持續、穩定和高效的基因轉移和表達系統。目前，大多數外源基因的表達選用病毒表達載體系統來完成。在各類病毒表達載體系統中：逆轉錄病毒（Retrovirus）載體通常僅能轉染主動分裂（actively?dividing）的細胞，而且具有插入突變或復制下一代病毒的能力，存在一定風險；腺病毒載體能確保外源基因的高效表達，但其免疫源性蛋白也有可能得到表達，引起宿主免疫反應，此外，其攜帶的外源基因并不整合進細胞染色體，因此在分裂的子代細胞中該外源基因的表達量持續下降；而慢病毒載體能穩定地整合到宿主細胞染色體內，能在分裂和非分裂的細胞中持續長期表達，因此，慢病毒載體系統已成為目前應用作為廣泛的表達載體之一。

當今，以慢病毒為載體的人類多種疾病（如帕金森病、地中海貧血等）的基因治療已進入臨床試驗，隨著分子影像學理論和技術的發展，活體示蹤技術在干細胞（包括腫瘤細胞）的基礎研究及臨床應用研究領域中扮演著越來越重要的角色，其通過顯像示蹤手段能無創傷性動態監測攜帶標記外源性報告基因慢病毒載體的干細胞在活體內的遷移、分布及生存狀態，具有廣闊的應用前景。

然而，采用慢病毒載體表達系統不可避免地將外源DNA片段（包括外源整合入干細胞染色體組，但這些整合片段對干細胞的生存、分化及增殖是否會產生不利影響尚不清楚，因此，在慢病毒載體表達系統完成其示蹤功能后，將外源性基因完全移除是避免宿主細胞生理功能受擾的最佳選擇。

發明內容

針對現有慢病毒表達載體系統存在的上述缺陷，本發明的目的之一是提供一種外源基因可移除的慢病毒受控表達載體系統。該系統包括表達質粒和包裝質粒，所述表達質粒包括反應質粒和調節質粒，并分別通過如下方法構建獲得：

（1）反應質粒的構建

通過慢病毒載體pSMPUW3’LTR?U3區域部分堿基的定點突變引入酶切位點，將loxP序列插入所述pSMPUW3’LTR，得突變質粒；用Tet-on系統反應質粒pTRE-Tight上的順式作用元件TRE和最簡化CMV啟動子序列取代所述突變質粒的啟動子序列，并將外源性報告基因插入所述突變質粒的多克隆位點MCS位置，得反應質粒；所述外源性報告基因處于所述TRE和最簡化CMV啟動子控制之下，并由Dox誘導表達。在慢病毒逆轉錄過程，其3’LTR?U3區域將被復制并轉移到5’LTR，一旦慢病毒表達載體系統整合入宿主基因組，將5’LTR和3’LTR將各產生一個loxP序列。

（2）調節質粒的構建

先對步驟（1）中定點突變的pSMPUW多克隆位點區進行定點突變引入Asc?I酶切位點，以利于下述CMV-rtTA2S-M2序列、內部核糖體進入位點EMCV序列及Cre-ER序列的插入；將Tet-on系統中的CMV-rtTA2S-M2序列、內部核糖體進入位點EMCV序列以及Cre-ER序列順序連接起來，插入步驟（1）中定點突變的pSMPUW的多克隆位點區域，得調節質粒；所述rtTA2S-M2序列和Cre-ER序列能夠在同一條mRNA鏈上各自獨立地進行翻譯和表達，生成rtTA2S-M2蛋白及Cre重組酶雌激素受體融合蛋白。

其進一步的技術方案為：

所述包裝質粒包括pRSV-Rev、pCMV-VSV-G、pCgpV。

所述突變位點序列為ACCGGT，突變后序列為ACGCGT，引入Mlu?I酶切位點。

所述外源性報告基因包括熒光蛋白、激酶、激素或細胞因子受體的表達基因。

4-OH-tamoxifen能誘導所述Cre重組酶雌激素受體融合蛋白與Hsp90解除結合，使Cre重組酶切除所述loxP序列之間的所述外源性報告基因和慢病毒載體序列。

本發明的再一目的是提供上述慢病毒受控表達系統在干細胞示蹤技術中的應用。將所述反應質粒和調節質粒分別與所述包裝質粒共轉染包裝細胞，得到反應慢病毒和調節慢病毒；將二者共轉染靶干細胞，利用Dox誘導所述外源性報告基因的表達并進行顯像示蹤，最后利用4-OH-tamoxifen誘導可隨時切除所述loxP序列之間的外源性報告基因。

本發明具有以下有益效果：