[發明專利]一種地皮菜水應激蛋白基因及其重組蛋白的制備和應用

有效

• 申請號: 201310291766.5
• 申請日: 2013-07-11
• 公開（公告）號: CN103409435A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 李卓玉;郭松佳;李宗偉;李漢卿;單樹花
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C07K14/405;C07K1/22;A61K38/16;A61P35/00
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司) 14105
• 代理人: 楊耀田

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種地皮菜水應激蛋白（water?stress?protein，wsp）基因、重組蛋白及其應用。

背景技術

地皮菜，學名普通念珠藻（Nostoc?commune?Vauch.），別名地耳、地踏菇、地衣、地木耳、地軟等，為藍藻科念珠藻屬的片狀藻類，喜歡生長在潮濕的土壤表面，或混于雜草基部的莖葉間、大樹的基部以及苔蘚植物群中，幾乎在全國各地都有分布。歷來民間有食用地皮菜的習慣，但對其開發研究的不多，地皮菜的營養價值可同木耳、發菜相媲美，它富含蛋白質、糖類、礦物質、維生素及鈣、磷、鐵等多種營養成分。此外，還含有特殊的活性成分如藍藻蛋白、胞外多糖等。因此，地皮菜是一種兼有醫療和食療功能的野生美味佳肴。

發明內容

本發明的目的在于利用基因工程技術，提供一種地皮菜水應激蛋白基因、重組蛋白及其制備方法，以及重組蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應用。

本發明提供的一種地皮菜水應激蛋白基因，其核苷酸序列是SEQ?ID?NO：1。

本發明提供的一種重組地皮菜水應激蛋白，其氨基酸序列是SEQ?ID?NO：2。

重組地皮菜水應激蛋白的表達和純化方法，步驟包括：

（1）將地皮菜藻體組織在液氮中磨成粉末，Trizol法提取總RNA，利用反轉錄酶獲得cDNA模板；

（2）根據Genebank中地皮菜水應激蛋白家族基因的同源序列設計上游引物SEQ?ID?NO：3和下游引物SEQ?ID?NO：4；以cDNA為模板，建立PCR反應體系，回收PCR產物測序鑒定；

（3）PCR產物經BamH?I和Xhol?I雙酶切，與同樣經過雙酶切的pET28a載體連接，轉化E.coli?BL21感受態細胞，獲得重組菌株E.coli?BL21(pET28a-wsp)；

（4）重組菌株E.coli?BL21(pET28a-wsp)培養過夜，轉接于含卡那霉素的LB培養基中，繼續震蕩培養3h，加0.5mM?IPTG誘導，并繼續培養4h,收集菌體；

（5）將預裝填料Ni-NTA?resin加到空柱子中，平衡柱子；再將菌體破碎、離心后的上清加到層析柱中進行親和純化；

（6）用平衡緩沖液洗脫非特異性結合的雜蛋白，再用含40-300mM咪唑PH為7.4的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，經2次純化，收集100-300mM洗脫液并用PBS緩沖液過夜透析，加入lOkD超濾管中，離心，獲得蛋白溶液，保存于-80℃。

本發明獲得的重組地皮菜水應激蛋白，SDS-PAGE電泳檢測表明，300mM咪唑的洗脫緩沖液的洗脫所得樣品有一條明顯主帶。通過與標準分子量比對，其分子量為35-40kD。

將獲得蛋白溶液作用于對數生長期的HT-29（人結腸癌細胞）、SW480（人結腸癌細胞）、FHC細胞（人正常結腸上皮細胞），其對結腸癌細胞增殖有顯著抑制作用，而對正常細胞沒有顯著抑制作用。

本發明提供了地皮菜水應激蛋白基因，并經克隆、表達純化獲得該蛋白。該重組地皮菜水應激蛋白具有抗腸癌細胞活性，可將該蛋白制備成抗腸癌藥物。本發明提供的利用基因工程技術重組合成的地皮菜抗結腸癌水應激蛋白的方法，簡單易行、成本低。

附圖說明

圖1實施例1地皮菜水應激蛋白基因片段的電泳圖

圖2實施例2經Ni-NTA?resin純化后所得的地皮菜水應激蛋白SDS-PAGE電泳圖

圖3實施例3地皮菜活性蛋白對人結腸癌細胞HT-29和SW480，人正常結腸上皮細胞FHC生長的影響。

具體實施方式

實施例1：地皮菜水應激蛋白基因的克隆與序列分析，步驟如下：