[發明專利]一種地皮菜水應激蛋白基因及其重組蛋白的制備和應用

有效

• 申請號: 201310291766.5
• 申請日: 2013-07-11
• 公開（公告）號: CN103409435A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 李卓玉;郭松佳;李宗偉;李漢卿;單樹花
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C07K14/405;C07K1/22;A61K38/16;A61P35/00
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司) 14105
• 代理人: 楊耀田

1.一種地皮菜水應激蛋白基因，其核苷酸序列是SEQ?ID?NO：1。

2.一種地皮菜水應激重組蛋白，其氨基酸序列是SEQ?ID?NO：2。

3.一種地皮菜水應激重組蛋白的表達和純化方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）將地皮菜藻體組織在液氮中磨成粉末，Trizol法提取總RNA，利用反轉錄酶獲得cDNA模板；

（2）根據Genebank中地皮菜水應激蛋白家族基因的同源序列設計上游引物SEQ?ID?NO：3和下游引物SEQ?ID?NO：4；以cDNA為模板，建立PCR反應體系，回收PCR產物測序鑒定；

（3）PCR產物經BamH?I和Xhol?I雙酶切，與同樣經過雙酶切的pET28a載體連接，轉化E.coli?BL21感受態細胞，獲得重組菌株E.coli?BL21(pET28a-wsp)；

（4）重組菌株E.coli?BL21(pET28a-wsp)培養過夜，轉接于含卡那霉素的LB培養基中，繼續震蕩培養3h，加0.5mM?IPTG誘導，并繼續培養4h,收集菌體；

（5）將預裝填料Ni-NTA?resin加到空柱子中，平衡柱子；再將菌體破碎、離心后的上清加到層析柱中進行親和純化；

（6）用平衡緩沖液洗脫非特異性結合的雜蛋白，再用含40-300mM咪唑PH為7.4的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，經2次純化，收集100-300mM洗脫液并用PBS緩沖液過夜透析，加入lOkD超濾管中，離心，獲得蛋白溶液，保存于-80℃。

4.如權利要求2所述的一種地皮菜水應激重組蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應用。