[發明專利]一種基于LAMP技術檢測大豆尖鐮孢菌的方法及使用的引物組合物

有效

• 申請號: 201310291748.7
• 申請日: 2013-07-11
• 公開（公告）號: CN103352078A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發明（設計）人: 鄭小波;陸辰晨;戴婷婷;王源超;張海峰
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種基于LAMP技術檢測大豆尖鐮孢菌的方法及使用的引物組合物。

背景技術

大豆枯萎病又稱萎蔫病、黃葉病、根腐病，是一種分布較廣、危害較重、防治困難的世界性土傳病害。美國Cromwell于1917年首次報道因鐮孢菌引起大豆枯萎病[2]。目前，該病害在中國[19,22,23]、美國[7,13]、印度、菲律賓及日本等國每年均有不同程度的發生，嚴重影響大豆的產量，對農業生產造成巨大的經濟損失。在我國，東北大豆產區枯萎病發生較為嚴重，王昌家等于1997年對黑龍江省部分農場2314公頃種植面積大豆進行病害調查時發現，大豆枯萎病株面積達2036公頃，占調查面積的88%；發病程度多為單株零星分布，病株率一般在1‰～6%，少數為點片發生。部分地區大豆田因連作多年，枯萎病發生嚴重，死苗達30%以上。幼苗、幼株患病造成缺苗斷壟，成株患病秕莢增多，百粒重降低50%，減產70%以上[20]。

近年來，隨著大豆種植面積不斷擴大，大豆枯萎病的發生呈擴大蔓延、加重危害的趨勢，全國各大豆產區均有枯萎病的發生，對大豆生產造成很大威脅。為了阻止大豆枯萎病傳播范圍的不斷擴大，使大豆枯萎病得到控制，需要對其進行快速、準確地檢測。

大豆枯萎病可由多種鐮孢菌侵染引起，迄今中國已報道引起大豆枯萎病的鐮孢菌有尖鐮孢菌（F.oxysporum）、茄腐鐮孢菌（F.solani）、木賊鐮孢菌（F.equiseti）、禾谷鐮孢菌（F.graninearum）、燕麥鐮孢菌（F.aveneum）、半裸鐮孢菌（F.semitectum）等。其中，尖鐮孢菌是最為常見的一種[17,18]。因此針對大豆尖鐮孢菌的分子檢測我們進行了一系列的研究。

傳統病原菌的分類、鑒定主要基于形態學特性、致病性測定等，但尖鐮孢菌在生長過程中形態變異較大，很多性狀不穩定，而且根據對不同寄主植物的致病性差異可分為不同的專化型[12]，有些專化型內還可進一步分為不同的小種，目前已報道的尖鐮孢菌專化型和小種有120多個[1]。同時傳統分類鑒定方法耗時長、靈敏度低、易受人為及環境等諸多因素的干擾[3]，不能在病害潛伏期和初發期做出診斷，很難對病害發生進行及時的監測和有效控制。

隨著分子生物學的發展，分子生物學技術已逐步應用到尖鐮孢菌的研究中[5,16]。基于普通PCR的方法已經成功用于檢測大豆尖鐮孢[21]，雖然普通PCR法在特異性和靈敏度上有較大的提高，但是檢測時間仍然比較長，大概4～5h，同時普通PCR方法依賴精密的溫度循環裝置，檢測過程復雜，不能滿足快速檢測的需求。

環介導等溫擴增技術（Loop-mediated?isothermal?amplification,LAMP）是日本的榮研株式會發明的一種新的核酸擴增技術（9），因為其操作簡單、快速、特異性高、成本低等優點，成為可以替代普通PCR的新的核酸擴增技術。它是針對靶基因的6個區域設計4種特異的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環鏈置換反應，60～65℃范圍60min內，大量合成目標DNA的同時伴隨有副產物——白色的焦磷酸鎂沉淀產生。由于LAMP擴增過程依賴識別靶序列6個獨立區域，所以反應特異性很強，并且核酸擴增過程是在恒溫條件下進行，普通水浴鍋或者有穩定熱源的設備就能滿足反應要求，檢測成本大大降低。

此外，普通PCR反應對產物進行凝膠電泳很容易造成產物擴散，這是實驗室污染的一個主要來源；而且溴化乙錠（EB）有巨毒，可累積致癌；長期觀察紫外燈也會對實驗人員造成一定程度的傷害。而LAMP反應只需在恒溫水浴鍋中進行，反應結束之后通過加入SYBR?Green?I觀察顏色和熒光變化便可直接判斷結果，大大降低了對實驗人員的傷害，并且增加了在田間的應用價值。

靶標基因的選擇是LAMP檢測的重要因素之一。普通PCR常用的靶標基因有核糖體基因轉錄間隔區（Internal?transcribed?space,ITS）[14]，然而許多學者認為該靶標不能夠很明確的區分鐮孢屬真菌[10,11]。