[發(fā)明專利]一種體外構(gòu)建三維立體組織的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310291478.X
• 申請日: 2013-07-11
• 公開（公告）號: CN104274864A
• 公開（公告）日: 2015-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐月敏;呂向國;馮超
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市第六人民醫(yī)院
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/36
• 代理公司: 上海精晟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種組織工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種體外構(gòu)建三維立體組織的方法，以及該方法構(gòu)建的三維立體組織。

背景技術(shù)

先天性或獲得性尿道疾病的手術(shù)修復(fù)是泌尿外科領(lǐng)域不斷探索的難題之一。組織工程技術(shù)的發(fā)展為尿道狹窄的修復(fù)提供了新的理念。其中脫細胞基質(zhì)作為細胞再生的支架是組織工程的一個重要內(nèi)容。目前對于脫細胞基質(zhì)研究最多的為小腸黏膜下脫細胞基質(zhì)（SIS），并應(yīng)用于臨床尿道修復(fù)，已取得較好效果。

小腸黏膜下脫細胞基質(zhì)是一種取材于豬小腸的異體組織，制作時去除小腸的黏膜層、漿膜層以及肌層，從而形成厚0.1cm的膜狀組織，其中含有膠原成分以及一些促進組織再生的生長因子，并且其與細胞外基質(zhì)十分接近，而有利于細胞的粘附和生長，最大優(yōu)點是沒有免疫原性。以往研究已證實其可作為一種良好的支架材料促進尿道修補處的上皮再生以及新生血管的形成，目前已作為一種產(chǎn)業(yè)化的成品。利用SIS進行尿道修復(fù)重建時可以明顯縮短手術(shù)時間并可避免自體取的一些并發(fā)癥（Yue-Min?Xu,Qiang?Fu,Ying-Long?Sa,JiongZhang,Lu-Jie?Song,Chao?Feng.International?Journal?of?Urology，2013,20:622-629）。

目前常選擇4層交迭SIS作為支架。但是4層SIS支架目前修復(fù)長段尿道缺損效果不理想，究其原因為單純的長段SIS在體內(nèi)不能保證充足的血供，且新生血管不能快速形成。而將種子細胞在體外與支架復(fù)合能夠促進新生血管的快速形成（H?Orabi,T?AbouShwareb,Y?Zhang,JJ.Yoo,A?Atala.Cell-Seeded?Tubularized?Scaffolds?for?Reconstruction?of?Long?Urethral?Defects:A?Preclinical?Study.2013,63,531–538）。

而對于應(yīng)用于尿道組織工程的種子細胞，傳統(tǒng)最常見的是采用尿路上皮細胞和平滑肌細胞，但是這種種子細胞的獲取常常需要膀胱活檢或切開獲得，取材方式比較不方便。而干細胞作為種子細胞存在腫瘤形成或血管瘤等嚴重并發(fā)癥。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種體外構(gòu)建三維立體組織的方法。

本發(fā)明提供了一種體外構(gòu)建三維立體組織的方法，包括以下步驟：

步驟1，分離培養(yǎng)上皮細胞和肌細胞；

步驟2，將小腸黏膜下層脫細胞基質(zhì)支架置入肌細胞懸液中，震蕩復(fù)合完成后，繼續(xù)培養(yǎng)；

步驟3，將上皮細胞懸液滴在經(jīng)步驟2處理得到后的支架的肌細胞層上，繼續(xù)培養(yǎng)得到三維立體組織。

其中，所述肌細胞可以為人體的各種肌細胞，例如骨骼肌細胞、平滑肌細胞或心肌細胞等，優(yōu)選為骨骼肌細胞。

其中，所述上皮細胞可以為人體各個部位的上皮細胞，例如口腔、喉部、鼻咽、器官、肺、胃、腸等的上皮細胞，優(yōu)選為舌上皮細胞。

優(yōu)選地，所述三維立體組織為三維立體尿道組織。

優(yōu)選地，步驟2中的震蕩復(fù)合在恒溫震蕩箱內(nèi)進行，溫度為25-40℃（優(yōu)選30-39℃，更優(yōu)選33-38℃，更優(yōu)選35-37℃），速度為50-150rpm/min（優(yōu)選60-120rpm/min，更優(yōu)選70-110rpm/min，更優(yōu)選75-95rpm/min），持續(xù)震蕩6-24h（優(yōu)選7-20h，更優(yōu)選8-16h，更優(yōu)選10-14h）。

優(yōu)選地，步驟2中所述肌細胞懸液由步驟1得到的肌細胞消化調(diào)整密度為（0.5-5）×10⁷/mL得到，其中，密度更優(yōu)選為（0.8-4）×10⁷/mL，更優(yōu)選為（1-3）×10⁷/mL，更優(yōu)選為（1.5-2.5）×10⁷/mL。

優(yōu)選地，步驟3中所述上皮細胞懸液由步驟1得到的上皮細胞消化調(diào)整密度為（0.2-3）×10⁶/mL得到，其中，密度更優(yōu)選為（0.4-2.5）×10⁶/mL，更優(yōu)選為（0.6-2.2）×10⁶/mL，更優(yōu)選為（0.8-1.6）×10⁶/mL，更優(yōu)選為（0.9-1.2）×10⁶/mL。

優(yōu)選地，步驟2中繼續(xù)培養(yǎng)時間為2-6d，每天換液。

優(yōu)選地，步驟3中繼續(xù)培養(yǎng)時間為2-6d，每天換液。

優(yōu)選地，步驟2中所述小腸黏膜下層脫細胞基質(zhì)支架在使用前先進行消毒處理。