[發明專利]一種橡膠樹原生質體培養植株再生的方法

無效

• 申請號: 201310291166.9
• 申請日: 2013-07-11
• 公開（公告）號: CN103299910A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 戴雪梅;周權男;黃華孫;華玉偉;李哲;黃天帶;孫愛花
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院橡膠研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃慧德

技術領域

本發明屬于植物組織和細胞工程領域，具體地說，涉及一種橡膠樹原生質體培養植株再生的方法。

背景技術

巴西橡膠樹（Hevea?brasiliensis?Müll.Arg.，以下簡稱橡膠樹）是重要的熱帶經濟作物，所產的天然橡膠是一種不可替代的工業原料和國防戰略物資。隨著國民經濟的發展，我國已成為世界上最大的天然橡膠消費國，年需求量達380萬噸以上，而我國目前年產量不超過80萬噸，自給率僅20%左右，遠未達到國際安全警戒線，如不盡快采取切實有效的措施提高天然橡膠的產量，將直接威脅到國家的經濟發展和國防安全。由于受氣候和地理條件的局限，在我國適合橡膠樹栽培的面積十分有限，無法靠擴大栽培面積來增產，只能通過改良現有品種，提高其單位面積產量來達到增產目的。現階段我國的橡膠產業主要還是通過傳統的有性雜交方式來改良品種，并以種子實生苗作為砧木，以具有優良特征的多齡樹芽條作為接穗，采用芽接方式進行種植。然而有性雜交僅能轉移部分核基因組，對于控制許多重要農藝性狀的胞質基因組的轉移無能為力，使得可利用的基因資源十分有限。此外，作為砧木來源的橡膠樹種子產量低、不耐儲藏且良莠不齊，使得優質砧木的篩選和利用受到很大限制。而通過建立高效的橡膠樹原生質體植株再生體系，在此基礎上開展橡膠樹體細胞雜交育種可克服上述問題。體細胞雜交不僅可以轉移核質基因組，還可以轉移胞質基因組，并在一定程度上克服遠緣雜交的不親和性，而且經原生質體融合獲得的體細胞雜種往往具有一定的雜種優勢，其抗逆性和花粉育性介于雙親之間甚至是高于親本，配合使用常規育種技術，有望選育出優良材料，在橡膠樹接穗和砧木的改良上均具有一定的潛力。

建立高效的原生質體植株再生體系是進行體細胞雜交育種的前提和基礎。國外學者于上世紀八十年代率先開展橡膠樹原生質體的分離和培養研究，然而由于橡膠樹原生質體的再生相當困難，而且不同品種對相同培養條件的反應存在很大差異，致使很多學者在這一研究領域上均未能成功。直至2000年Sushamakumari等首次報道了橡膠樹品種PRII105的原生質體培養成功獲得完整的再生植株，然而此后一直未再有其它品種的成功報道。究其原因，可能是該培養體系不太適用于橡膠樹其它品種，尤其是國內橡膠樹品種的原生質體再生培養，而且該培養體系存在以下不足：（1）原生質體培養采用的KPR培養基（Abdullah等，1986）成分復雜，含有多種稀有昂貴的維生素，實驗成本高且配制程序繁雜；（2）采用禾本科黑麥草懸浮細胞作為看護細胞，不易獲得，而且經看護培養后的橡膠樹原生質體分裂形成細胞克隆的頻率較低。鑒于橡膠樹原生質體培養再生植株存在的上述技術瓶頸，目前我國在這一領域尚未有任何相關的研究報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種簡單易行且普遍適用于國內橡膠樹品種原生質體培養植株再生的方法。

為了實現本發明的目的，本發明一種橡膠樹原生質體培養植株再生的方法，包括胚性細胞懸浮系的建立、原生質體的分離和純化、原生質體的看護培養、原生質體再生細胞克隆的繼代增殖、體細胞胚的誘導及植株再生。具體步驟如下：

（1）胚性細胞懸浮系的建立：挑取2～4g常規方法誘導的橡膠樹未成熟花藥或內珠被胚性愈傷組織，轉入含20～40ml液體培養基的100ml三角瓶中，置于100rpm搖床上，28±1℃、黑暗條件下進行懸浮培養，每周繼代一次，持續繼代60～90天得到穩定均質的胚性懸浮細胞系。

所述的液體培養基的組成為：改良的MS基本培養基、0.5～1.5mg·L^-16-BA、0.5～2mg·L^-1NAA、0.5～2mg·L^-12,4-D、0.1～0.4g·L^-1天冬酰胺、0.2～0.6g·L^-1酸性水解酪蛋白、60～90ml·L^-1椰子水和40～60g·L^-1蔗糖；液體培養基的pH5.8，高溫高壓滅菌。

MS培養基的改良成分為：MgSO₄·7H₂O500mg·Ｌ^-1、KH₂PO₄400mg·L^-1、CaCl₂250mg·L^-1、MnSO₄·H₂O35mg·L^-1、CuSO₄·5H₂O0.2mg·L^-1。