[發明專利]一種橡膠樹原生質體培養植株再生的方法

無效

• 申請號: 201310291166.9
• 申請日: 2013-07-11
• 公開（公告）號: CN103299910A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 戴雪梅;周權男;黃華孫;華玉偉;李哲;黃天帶;孫愛花
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院橡膠研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃慧德

1.一種橡膠樹原生質體培養植株再生的方法，其特征在于包括胚性細胞懸浮系的建立、原生質體的分離和純化、原生質體的看護培養、原生質體再生細胞克隆的繼代增殖、體細胞胚的誘導及植株再生，步驟如下：

（1）胚性細胞懸浮系的建立：將常規方法誘導的橡膠樹未成熟花藥或內珠被胚性愈傷組織轉入液體培養基中，置于搖床上進行懸浮培養，每周繼代一次，得到穩定均質的懸浮細胞系；

（2）原生質體的分離和純化：取穩定均質后繼代培養第3～7天的胚性懸浮細胞1～3g轉至100ml三角瓶中，加入10～30ml溶解于原生質體洗滌液的酶混合物中進行原生質體的酶解分離。酶解后采用過濾離心法進行純化，所得的原生質體沉淀用適量原生質體洗滌液和原生質體液體培養基漂洗，最后以適當密度懸浮于原生質體液體培養基中；

（3）原生質體的看護培養：以繼代保存于液體培養基中的橡膠樹雜交品種H.brasiliensis×H.nitida的懸浮細胞系作為看護細胞，采用看護培養的方法進行橡膠樹原生質體的培養。吸取懸浮于原生質體液體培養基中、密度調整為0.1×10⁶～5×10⁶個/ml的橡膠樹原生質體懸液0.5～1.0ml接種至含3%～10%看護細胞的看護培養基中，置于28±1℃、黑暗條件下進行看護培養45～60天，期間每兩周更新一次看護培養基，得到肉眼可見的原生質體再生細胞克隆；

（4）原生質體再生細胞克隆的繼代增殖：挑取直徑為2mm以上的原生質體再生細胞克隆轉至繼代培養基中，置于28±1℃、黑暗條件下進行增殖培養，每20天繼代一次；

（5）體細胞胚的誘導及植株再生：將繼代增殖的原生質體再生細胞克隆轉至體細胞胚誘導培養基中，于28±1℃、黑暗條件下進行體細胞胚的誘導，25～40天后開始出現白色球形胚，繼續在體細胞胚誘導培養基中培養至體細胞胚發育成熟，隨后將成熟的子葉形胚轉至體細胞胚萌發培養基上黑暗培養，15～30天后開始抽芽長根，隨后將其轉至28±1℃、光照條件下繼續培養，獲得完整的原生質體再生植株。

2.根據權利要求1所述的一種橡膠樹原生質體培養植株再生的方法，其特征在于所述的液體培養基的組成為：改良的MS基本培養基、0.5～1.5mg·L^-16-BA、0.5～2mg·L^-1NAA、0.5～2mg·L^-12,4-D、0.1～0.4g·L^-1天冬酰胺、0.2～0.6g·L^-1酸性水解酪蛋白、60～90ml·L^-1椰子水和40～60g·L^-1蔗糖。

3.根據權利要求1所述的一種橡膠樹原生質體培養植株再生的方法，其特征在于所述原生質體洗滌液的組成為：12～18g·L^-1KCl、5～10g·L^-1CaCl₂、0.5～1g·L^-1MES和8%～12%甘露醇；

所述的酶混合物的組成為：1%～3%纖維素酶、0.05%～0.5%果膠酶和0.1%～1%離析酶；

所述的原生質體液體培養基的組成為：改良的MS基本培養基、0.5～1.5mg·L^-16-BA、0.5～2mg·L^-1NAA、1～4mg·L^-12,4-D、60～80g·L^-1葡萄糖、0.05～0.2g·L^-1MES、60～90ml·L^-1椰子水和40～60g·L^-1蔗糖。