[發明專利]鴨坦布蘇病毒病E-ELISA檢測試劑盒及其制備方法

在審

• 申請號: 201310290098.4
• 申請日: 2013-07-11
• 公開（公告）號: CN104280551A
• 公開（公告）日: 2015-01-14
• 發明（設計）人: 張云;劉明;陳志峰
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王旭

技術領域

本發明提供一種以鴨坦布蘇病毒E蛋白為包被抗原的酶聯免疫吸附試驗(E-ELISA)檢測試劑盒，本發明還提供所述試劑盒的制備方法。?

背景技術

黃病毒(Flavivirus)是通過節肢動物傳播的，屬于黃病毒家族成員。其基因組由單股正鏈RNA組成，約為10.5kb，由一個開放閱讀框組成，共編碼3個結構蛋白和7個非結構蛋白，該病毒在3′末端沒有poly-A尾巴，病毒粒子由一個外殼蛋白(C)，一個膜蛋白(E)，一個小的非糖基化蛋白(M)，7個非結構蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)組成。在大多數黃病毒中，E蛋白定位于病毒粒子表面，病毒在與受體結合、侵入、細胞融合過程中起重要作用^[1-2]。?

2010年4月以來，一種引起產蛋量急劇下降的新型傳染病在中國各地的水禽飼養區大面積爆發，感染鴨的種類包括：北京鴨、番鴨、麻鴨、鵝等^[3-5]。該病引起高達100％的發病率和小于5％的死亡率，產蛋率在5天內降至10％左右。剖檢后發現病鴨具有嚴重的卵巢出血、卵巢炎、卵巢萎縮現象。由于該病導致繁殖力的急劇下降給許多養殖場帶來了嚴重的經濟損失。經過病毒分離和鑒定，該病毒鑒定為鴨坦布蘇病毒(在本發明中也簡稱為“坦布蘇病毒”)。?

該病近年來在我國一些省、市、自治區均有流行，給水禽養殖業造成經濟損失慘重。國內外用于坦布蘇病毒病診斷方法為病毒常規分離和鑒定。病毒分離和鑒定技術(診斷過程需7-10天時間)，費時、費力，還需要專業人員和電鏡等設備；很難在臨床上推廣和應用。為此急需建立一種敏感、準確、快速、簡便的鴨坦布蘇病毒病抗體檢測方法。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是廣泛用于動物疾病診斷的一種方法，更適合短時間內檢測大批量的血清樣品，具有較好的特異性和較高的靈敏度。?

隨著我國人民生活水平的提高，水禽養殖業的迅猛發展，水禽發生坦布蘇病毒病的比率也隨之上升。因此，急需研制和開發坦布蘇病毒抗體監測試劑盒，為國內的坦布蘇病毒的防治提供技術支持。國外科研小組的報告中，已經證明E蛋白是坦布蘇病毒的主要免疫原性蛋白，免疫原性好，可誘導機體產生免疫保護性抗體。通過對國內不同的分離株序列的比較分析，設計E蛋白PCR引物，E蛋白原核表達純化后，以其為包被抗原建立了一種快速檢測坦布蘇病毒抗體的ELISA方法。?

發明內容

本發明提供一種以鴨坦布蘇病毒E蛋白為包被抗原的酶聯免疫吸附試驗(E-ELISA)檢測試劑盒，所述試劑盒包含標準對照陽性鴨血清、標準對照陰性鴨血清、鴨坦布蘇病毒E蛋白所包被的ELISA板、羊抗鴨酶標二抗及其它試劑，將標準對照陽性鴨血清、標準對照陰性鴨血清、鴨坦布蘇病毒E蛋白所包被的ELISA板、羊抗鴨酶標二抗及其它試劑組裝，即得到所述試劑盒，其他成分包括樣品稀釋液，10×濃縮洗液，TMB底物顯色液，終止液，所述試劑盒特征在于酶標ELISA板的包被抗原為純化的原核表達的坦布蘇病毒E蛋白，經過定量后包被ELISA板后得到；陽性標準血清為鴨坦布蘇病毒免疫無特定病原(SPF)鴨后得到，陰性標準血清為SPF鴨血清。?

本發明制備的E-ELISA檢測試劑盒用于鴨坦布蘇病毒感染后的抗體檢測。?

如上所述，從鴨坦布蘇病毒TA株(自行分離)提取RNA，反轉錄后經坦布蘇病毒E蛋白基因特異性引物P1和P2(引物序列見表1)擴增得到坦布蘇病毒E蛋白的編碼核苷酸序列(SEQ?ID?No.1)，將其克隆到適當的原核細胞表達載體中，在相應的原核宿主細胞中進行表達和純化，得到坦布蘇病毒E蛋白(SEQ?ID?No.2)。經過定量后可用于包被ELISA板。?

為便于純化，經原核重組表達的坦布蘇病毒E蛋白的N端帶有His標簽，便于純化。?

本領域技術任意應該理解，利用坦布蘇病毒E蛋白包被ELISA板可?以按照本領域的常規方法進行。例如，所述的E蛋白包被的ELISA板可以由以下過程制備得到：?