[發明專利]CRP非免疫納米金檢測試紙條及其制備

無效

• 申請號: 201310289752.X
• 申請日: 2013-07-11
• 公開（公告）號: CN104280550A
• 公開（公告）日: 2015-01-14
• 發明（設計）人: 游紹進;陳瓊;張鉦;李為
• 申請（專利權）人: 蘇州友林生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于醫療檢測器械領域，具體而言，本發明涉及檢測CRP的非免疫納米金試紙條及其制備方法。

背景技術

C-反應蛋白(本文簡稱CRP)是由5個相同的亞單位以非共價鍵結合而成的血清β球蛋白。該蛋白由肝細胞合成，在人的血清、腦脊液、胸腹水等多種體液中均可測出。正常人CRP的濃度很低(0.068～8.2mg/L)，但在組織損傷、急性感染發生后6～8h開始升高，24～48h達峰值，可達正常值的幾百倍甚至上千倍，升高幅度與感染程度成正比，炎癥治愈后濃度迅速下降，7～12天可恢復正常水平；CRP在病毒感染時不會升高，其變化不受病人的個體差異、機體狀態和治療藥物的影響。所以，CRP的持續增高暗示機體存在慢性炎癥或自身免疫疾病，如常規C反應蛋白試驗應用于存在細菌或病毒感染、慢性炎癥性疾病(如：類風濕關節炎)風險的患者，其需要的檢測區間為10-1000mg/L。另外，CRP也是診斷和預測心血管事件發生、發展的有效指標，根據美國心臟學會、美國疾病預防與控制中心定義的風險標準，檢測低于1.0mg/L為低風險，檢測1.0-3.0mg/L為一般風險，檢測高于3.0mg/L為高風險。近年來，主要采用ELISA檢測CRP，其靈敏度通?？蛇_到0.15mg/L。

ELISA檢測需要試驗室設備，用時長，不容易用于日常即時檢測。所以，中國專利201010236071和201120160566分別公開了CRP膠體金免疫層析檢測試紙(條)，通過顯色觀察來判讀，無需試驗室設備，方便隨時隨地使用。這些文獻公開的都是基于抗原-抗體反應的免疫學原理進行的，其中在硝酸纖維素膜上設有包被有C反應蛋白抗體的檢測線。然而，本發明人研究發現，抗體、抗原等大蛋白質分子受熱容易變性，尤其在日?？山佑|的高溫(如：40℃)下，可加速穩定性喪失，其檢測靈敏度甚至可以下降兩個數量級，而試紙條的使用和儲運環境恰恰比較隨意而惡劣，因此不利于長時間保存，因此不方便日常檢測。

本發明的發明人經過長期艱苦研究，開發出了一種新的檢測CRP的非免疫納米金試紙條的制備方法，其中利用寡核苷酸而非抗體分子來標記納米金顆粒和檢測線。由此制備獲得的非免疫納米金試紙條使用簡便、靈敏、出結果快捷、無需復雜儀器及特別技巧，尤其是穩定好，即使在較惡劣環境下長期保存、運輸，也基本不影響檢測靈敏度，從而便于在日常使用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新的納米金試紙條的制備方法，該試紙條能夠用于檢測CRP，而且它不采用抗原-抗體檢測的免疫學原理。另外，本發明還提供了由該方法制備的試紙條以及其應用等。

具體而言，在第一方面，本發明提供了檢測CRP的非免疫納米金試紙條的制備方法，所述試紙條包括樣品墊、納米金結合墊、硝酸纖維膜、吸水墊和支撐板，其特征在于，該制備方法包括：

A，將標記有生物素的第一寡核苷酸標記到納米金顆粒上，獲得第一寡核苷酸標記的納米金顆粒；

B，將步驟A獲得的第一寡核苷酸標記的納米金顆粒噴在結合墊上，獲得納米金結合墊；

C，將第二寡核苷酸噴在硝酸纖維膜上形成檢測線，將親和素噴在硝酸纖維膜上形成質控線，獲得帶有檢測線和質控線的硝酸纖維膜；和

D，以樣品墊、納米金結合墊、帶有檢測線和質控線的硝酸纖維膜和吸水墊這4部件依次為序排列，相鄰兩部件間邊緣接觸或重合，固定在支撐板上，制成該檢測CRP的非免疫納米金檢測試紙條，

其中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序列不同。

本發明采用非免疫機理，利用寡(聚)核苷酸與CRP的特異結合，來實現試紙條對CRP的檢測。寡核苷酸能夠為本領域技術人員操作，可以在其末端進行標記，如第一寡核苷酸的5’末端標記生物素。在本文中，如無相反指示，寡核苷酸為單鏈寡核苷酸，其長度為10-40nt，優選為12-35nt，如16-30nt。

親和素是能與生物素結合的物質，有多種市售的親和素可供選擇。優選在本發明第一方面的方法中，親和素是鏈球菌親和素。

檢測線和質控線不能重合。優選在本發明第一方面的方法中，檢測線和質控線間距為0.4-1cm，優選為0.6cm。

理論上，樣品墊、納米金結合墊、帶有檢測線和質控線的硝酸纖維膜和吸水墊這4部件中相鄰兩部件邊緣接觸，就能完成納米金顆粒的轉移，但是優選邊緣重合。優選在本發明第一方面的方法中，重合1-3mm，如重合2mm。