[發明專利]真菌固態發酵生產脫落酸的方法

無效

• 申請號: 201310288884.0
• 申請日: 2013-07-10
• 公開（公告）號: CN103409474A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 戚海樂
• 申請（專利權）人: 四川科瑞森生物工程有限公司
• 主分類號: C12P7/42
• 分類號: C12P7/42;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

?本發明涉及一種脫落酸的生產方法，特別是一種真菌固態發酵生產脫落酸的方法。背景技術

?脫落酸（Abscisic?Acid,縮寫為ABA)是植物五大天然生長調節劑之一。單純的天然活性脫落酸（+)-ABA的生產成本極高。由于昂貴的價格和活性上的差異，脫落酸一直未被廣泛應用于農業生產當中。

現有的脫落酸生產方法包括：（1）植物提取法（2）化學合成法（3）真菌液態發酵法。

植物提取法是脫落酸發現早期所使用的提純方法。通過富集、濃縮、萃取等一系列步驟提取植物中的脫落酸。由于植物中本身含有的脫落酸極其稀少，導致該方法無法應用到工業生產當中。

脫落酸存在兩種光學構型：（+）-ABA、（-）-ABA。現有植物中只存在（+）-ABA，而且只有（+）-ABA才具有生理學活性。通過化學合成法生產的脫落酸包含兩種光學構型，為外消旋脫落酸。與單純的天然脫落酸相比，活性低1/3-1/2。

真菌液態發酵法是現階段流行的天然脫落酸生產方法。該方法采用灰葡萄孢霉菌進行液態發酵生產。灰葡萄孢霉菌是絲狀真菌，其天然生長環境并非液態培養形式。因此，液態發酵法并不能發揮該系列真菌的最高發酵能力。其次，液態發酵法存在投資巨大、易染菌、成本偏高、外排廢液污染等問題，這不利于整個脫落酸生產產業的發展和應用。特別是外排高濃度有機廢液，不僅會造成企業承受很大的環保壓力，更重要的是對生態環境造成破壞。

發明內容

本發明的目的在于提供一種真菌固態發酵生產脫落酸的方法。本發明通過固態發酵法生產天然脫落酸，與液態發酵法相比，具有發酵水平高、投資小、染菌率低、無有機廢液等優點。除此之外，利用該方法生產天然脫落酸，在提純工藝上極為簡單，可以通過常規的有機物提取方法，即可得到超高純度的天然脫落酸結晶。這在很大程度上，可以推進整個天然脫落酸產業的工業化和其在農業生產上的應用。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種真菌固態發酵生產脫落酸的方法，具體步驟如下：

（1）菌種制備

?????篩選正誘變的灰葡萄孢霉菌為生產菌種，再通過活化和擴大培養，形成平皿固態菌種，備用；

????（2）發酵培養基制備

發酵培養基按照重量百分比的原料為：小米15-25%、大米15-25%、葡萄糖0.1-2%、蔗糖0.1-4%、蛋白胨1-4%、CaCO_3?0.5-1.5%、Na₂HPO₄·12H₂O?0.1-0.5%、Ca(HO)_2??0.5-1.5%、MgSO_4??0.01-0.05%、提純殘留物0.5-1%，其他成份為水；其中，提純殘留物是指發酵產物提取過程中分離濃縮得到的非脫落酸物質；

發酵培養基的制作方法：將所有原料混合，加水拌勻，置于蒸飯柜中進行預熱處理；將預熱好的培養基打散，稱量分裝到培養淺盤中，每盤裝取400-800g培養基；將培養淺盤置于滅菌柜中，進行高壓滅菌，備用；

（3）生產接種

將步驟（1）制備的平皿固態菌種碾碎，均勻分散到步驟（2）滅菌后的培養淺盤當中；每個培養淺盤使用2-4個平皿菌種；接種重量為培養基的6-10%；

（4）發酵培養

將已接種的培養淺盤移入發酵間，置于發酵培養裝置中進行培養；培養模式如下：

培養0-48小時的平均溫度為26.5-28.5℃、平均通氣量為5-10L/100盤/天；

培養48-96小時的平均溫度為26-28℃、平均通氣量為15-20L/100盤/天；

培養96-216小時的平均溫度為22-24.5℃、平均通氣量為40-50L/100盤/天；

培養216-288小時的平均溫度為25.5-26.5℃、平均通氣量為10-20L/100盤/天；

（5）天然脫落酸提純：對步驟（4）的發酵產物進行提純即得天然脫落酸。

作為本發明進一步的方案：步驟（1）中通過天然篩選、紫外誘變、硫酸二乙酯誘變、YAG倍頻脈沖激光照射以及生產中動態篩選獲得正誘變的灰葡萄孢霉菌。

作為本發明再進一步的方案：所述生產中動態篩選的具體步驟如下：

1）菌種采集：在日常生產過程中，每批次隨機選擇10-50盤無污染、長勢優良的發酵淺盤；從發酵淺盤中挑取菌種，置于PDA平皿中，26-30℃靜止培養5-7天，制成待測試菌種；