[發明專利]真菌固態發酵生產脫落酸的方法

無效

• 申請號: 201310288884.0
• 申請日: 2013-07-10
• 公開（公告）號: CN103409474A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 戚海樂
• 申請（專利權）人: 四川科瑞森生物工程有限公司
• 主分類號: C12P7/42
• 分類號: C12P7/42;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種真菌固態發酵生產脫落酸的方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)菌種制備

篩選正誘變的灰葡萄孢霉菌為生產菌種，再通過活化和擴大培養，形成平皿固態菌種，備用；

(2)發酵培養基制備

發酵培養基按照重量百分比的原料為：小米15-25%、大米15-25%、葡萄糖0.1-2%、蔗糖0.1-4%、蛋白胨1-4%、CaCO_3?0.5-1.5%、Na₂HPO₄·12H₂O?0.1-0.5%、Ca(HO)_2??0.5-1.5%、MgSO_4??0.01-0.05%、提純殘留物0.5-1%，其他成份為水；其中，提純殘留物是指發酵產物提取過程中分離濃縮得到的非脫落酸物質；

發酵培養基的制作方法：將所有原料混合，加水拌勻，置于蒸飯柜中進行預熱處理；將預熱好的培養基打散，稱量分裝到培養淺盤中，每盤裝取400-800g培養基；將培養淺盤置于滅菌柜中，進行高壓滅菌，備用；

(3)生產接種

將步驟（1）制備的平皿固態菌種碾碎，均勻分散到步驟（2）滅菌后的培養淺盤當中；每個培養淺盤使用2-4個平皿菌種；接種重量為培養基的6-10%；

(4)發酵培養

將已接種的培養淺盤移入發酵間，置于發酵培養裝置中進行培養；培養模式如下：

培養0-48小時的平均溫度為26.5-28.5℃、平均通氣量為5-10L/100盤/天；

培養48-96小時的平均溫度為26-28℃、平均通氣量為15-20L/100盤/天；

培養96-216小時的平均溫度為22-24.5℃、平均通氣量為40-50L/100盤/天；

培養216-288小時的平均溫度為25.5-26.5℃、平均通氣量為10-20L/100盤/天；

(5)天然脫落酸提純：對步驟（4）的發酵產物進行提純即得天然脫落酸。

2.根據權利要求1所述的真菌固態發酵生產脫落酸的方法，其特征在于，步驟（1）中通過天然篩選、紫外誘變、硫酸二乙酯誘變、YAG倍頻脈沖激光照射以及生產中動態篩選獲得正誘變的灰葡萄孢霉菌。

3.根據權利要求2所述的真菌固態發酵生產脫落酸的方法，其特征在于，所述生產中動態篩選的具體步驟如下：

菌種采集：在日常生產過程中，每批次隨機選擇10-50盤無污染、長勢優良的發酵淺盤；從發酵淺盤中挑取菌種，置于PDA平皿中，26-30℃靜止培養5-7天，制成待測試菌種；

發酵培養：將菌種接種于含培養基的發酵淺盤當中進行培養；培養條件與日常生產保持一致；

突變菌株檢測：對發酵物中的脫落酸含量進行檢測，測得待測試菌種的發酵率；若待測試菌種的發酵率無明顯變化，則將其舍棄，對應的發酵產物并入日常生產，提取其中脫落酸；若出現正變株，則對其進行穩定性測試；

正變株穩定性測試：從正變株中挑出3-8株，并測定其傳代3-8代的菌種發酵率；發酵培養條件與日常生產保持一致；若菌種在3-8代內未出現明顯衰退，則視其通過穩定性測試；

正變株投入使用：將通過穩定性測試的正變株投入到生產使用中，并繼續以上動態篩選步驟。

4.根據權利要求1所述的真菌固態發酵生產脫落酸的方法，其特征在于，步驟（1）中通過培養基A對灰葡萄孢霉菌進行活化培養，所述培養基A按照重量百分比的原料為：土豆10-20%、瓊脂1-3%、葡萄糖0.1-1%、乳糖0.1-0.5%、蔗糖1-2%、Ca(NO3)2·4H2O?0.01-0.05%、蛋白胨1-2%、Na2HPO4·12H2O?0.1-0.5%，其他成份為水。

5.根據權利要求1所述的真菌固態發酵生產脫落酸的方法，其特征在于，步驟（1）中通過培養基B對活化的葡萄孢霉菌進行擴大培養，培養基B用于固態接種；所述培養基B按照重量百分比的原料為：小米5-10%、大米5-10%、葡萄糖0.1-1%、蔗糖1-2%、蛋白胨1-2%、Ca(NO₃)₂·4H₂O?0.01-0.05%、Na₂HPO₄·12H₂O?0.1-0.5%、瓊脂1-3%，其他成份為水；所述小米、大米需蒸煮、過濾取汁。