[發明專利]一種高效提取用于PCR擴增的地下水微生物DNA的方法

有效

• 申請號: 201310288695.3
• 申請日: 2013-07-11
• 公開（公告）號: CN103333883A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 張雪峰;鄭春麗;王建英;楊彪;姚衛華;高曉玲;林忠;呂保義
• 申請（專利權）人: 內蒙古科技大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279
• 代理人: 蔣常雪

技術領域

本發明涉及一種基因組DNA的提取方法，具體涉及一種高效提取用于PCR擴增的地下水微生物DNA的方法。

背景技術

由于工廠廢水、生活廢水、生活垃圾的大量排放，化肥、農藥的大量使用致使地下水污染日趨嚴重，目前全國有90%的地下水都遭到了不同程度的污染，其中60%為嚴重污染，水污染正威脅著全人類的生活狀況甚至生命。及時的檢測地下水是否被污染以及污染程度，以及如何治理水污染已成為當今社會的重要話題。

地下水微生物可以科學評價地下水的質量變化，而目前可在實驗室培養的微生物還不到自然界的1%，還有很多微生物沒有被人類所認識。隨著分子生物技術的引入，使得地下水微生物降低了對培養的依賴，而提取基因組DNA則成為研究地下水微生物分子生態學的前提。地下水成分復雜，含有大量的有機或無機化合物存在，某些酶抑制劑、重金屬離子等都會干擾提取反應的進行，這給地下水微生物基因組DNA的提取及PCR擴增帶來了困難。

分子生物技術研究地下水微生物菌群結構的實質是用地下水微生物DNA的不均一性來反映地下水微生物種群結構特征。因此，要獲得高濃度、大片段、多樣性高、具有代表意義的地下水微生物基因組DNA是研究地下水微生物菌群結構的分子生物學基礎。而地下水中含有很多有可能不利于DNA提取的物質，這些物質可能對內切酶消化、PCR擴增、雜交等后續操作產生強烈的影響，因此提取高純度、質量好的DNA是非常重要的。且地下水微生物數量少，提取難度高，要想簡單有效的提取出高質量地下水微生物基因組DNA是一種巨大的挑戰。

發明內容

本發明需要解決的技術問題就在于克服現有技術的缺陷，提供一種高效提取用于PCR擴增的地下水微生物DNA的方法，該方法能夠高效提取出高質量的地下水微生物基因組DNA，且操作方法簡單，DNA的提取純度高，能夠滿足PCR擴增的要求。

為解決上述問題，本發明采用技術方案為：

一種高效提取用于PCR擴增的地下水微生物DNA的方法，該方法包括收集地下水微生物、裂解地下水微生物細胞、純化細胞裂解液和提取純化微生物基因組DNA步驟。

本發明為了實現高效提取地下水微生物基因組DNA，較佳的技術方案有，該方法的具體步驟為：

第一步、收集地下水微生物：取地下水樣品用無菌微孔濾膜過濾收集微生物，再用含有十六烷基三甲基溴化銨的緩沖液將無菌微孔濾膜上的微生物洗脫下來制得微生物細胞液；緩沖液中含有十六烷基三甲基溴化銨，能夠達到較好的洗脫效果。

第二步、裂解地下水微生物細胞：向微生物細胞液中加入溶菌酶進行溶菌酶酶解，將溶菌酶酶解后的裂解液轉入離心管，向離心管中加入蛋白酶K進行蛋白酶酶解，溫水水浴后離心，得到細胞裂解上清液；本發明使用溶菌酶和蛋白酶K對細胞進行裂解，能夠達到較好的裂解效果，并且避免了微生物基因組DNA被生物酶破壞，保證了DNA的完整性。

第三步、純化細胞裂解液：將細胞裂解上清液進行多次離心純化后，得到粗提DNA溶液；進行離心純化后，去除了細胞膜及細胞器，得到粗提DNA溶液。

第四步、純化微生物基因組DNA：將粗提DNA溶液進行離心純化、用體積濃度為70%的乙醇抽提后得到純化的微生物基因組DNA；本發明使用體積濃度為70%的乙醇抽提純化基因組DNA，能夠有效除去雜質，得到高純度的基因組DNA。

本發明為了提高基因組DNA的提取效果，較佳的技術方案還有，第二步中所述裂解地下水微生物細胞的操作過程為：

①溶菌酶酶解：向微生物細胞液中加入溶菌酶溶液，至微生物細胞液中的溶菌酶濃度為10mg/mL，于30℃～40℃條件下水浴1～2h后轉入新離心管；

②蛋白酶酶解：向溶菌酶酶解后的微生物細胞液中加入蛋白酶K，至微生物細胞液中蛋白酶K的濃度0.2mg/mL，再加入100微升質量濃度為20%的十二烷基硫酸鈉、40微升5mol/L的NaCl溶液和20微升2mol/L的Na₃PO₄溶液，于53℃水浴2h后，以轉速9000～12000r/min離心5min后取上清，得到細胞裂解上清液。本發明在蛋白酶K酶解過程中加入Na₃PO₄溶液，能夠達到更好的酶解效果，提高了基因組DNA的純度，避免了DNA被其它生物酶分解。

本發明為了純化細胞裂解液，得到高純度的基因組DNA，較佳的技術方案還有，第三步中所述純化細胞裂解液的操作過程為：