[發明專利]一種高效提取用于PCR擴增的地下水微生物DNA的方法

有效

• 申請號: 201310288695.3
• 申請日: 2013-07-11
• 公開（公告）號: CN103333883A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 張雪峰;鄭春麗;王建英;楊彪;姚衛華;高曉玲;林忠;呂保義
• 申請（專利權）人: 內蒙古科技大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279
• 代理人: 蔣常雪

1.一種高效提取用于PCR擴增的地下水微生物DNA的方法，其特征在于，該方法包括收集地下水微生物、裂解地下水微生物細胞、純化細胞裂解液和提取純化微生物基因組DNA步驟。

2.如權利要求1所述的高效提取用于PCR擴增的地下水微生物DNA的方法，其特征在于，該方法的步驟為：

第一步、收集地下水微生物：取地下水樣品用無菌微孔濾膜過濾收集微生物，再用含有十六烷基三甲基溴化銨的緩沖液將無菌微孔濾膜上的微生物洗脫下來制得微生物細胞液；

第二步、裂解地下水微生物細胞：向微生物細胞液中加入溶菌酶進行溶菌酶酶解，將溶菌酶酶解后的裂解液轉入離心管，向離心管中加入蛋白酶K進行蛋白酶酶解，溫水水浴后離心，得到細胞裂解上清液；

第三步、純化細胞裂解液：將細胞裂解上清液進行多次離心純化后，得到粗提DNA溶液；

第四步、純化微生物基因組DNA：將粗提DNA溶液進行離心純化、用體積濃度為70%的乙醇抽提后得到純化的微生物基因組DNA。

3.如權利要求2所述的高效提取用于PCR擴增的地下水微生物DNA的方法，其特征在于，第二步中所述裂解地下水微生物細胞的操作過程為：

①溶菌酶酶解：向微生物細胞液中加入溶菌酶溶液，至微生物細胞液中的溶菌酶濃度為10mg/mL，于30℃～40℃條件下水浴1～2h后轉入新離心管；

②蛋白酶酶解：向溶菌酶酶解后的微生物細胞液中加入蛋白酶K，至微生物細胞液中蛋白酶K的濃度0.2mg/mL，再加入100微升質量濃度為20%的十二烷基硫酸鈉、40微升5mol/L的NaCl溶液和20微升2mol/L的Na₃PO₄溶液，于53℃水浴2h后，以轉速9000～12000r/min離心5min后取上清，得到細胞裂解上清液。

4.如權利要求3所述的高效提取用于PCR擴增的地下水微生物DNA的方法，其特征在于，第三步中所述純化細胞裂解液的操作過程為：

①向細胞裂解上清液內加入細胞裂解上清液體積0.1～0.3倍的溶液III混勻，冰浴10～15min后，于4℃溫度下12000r/min離心10～15min，去除沉淀后得到一號上清液；

②向一號上清液中加入一號上清液體積2倍的預冷的無水乙醇，于-20℃溫度下沉淀60min，再于4℃溫度下12000r/min離心10～15min，去除上清液后得到一號沉淀；

③向一號沉淀中加入400～500微升提取緩沖液溶解一號沉淀得到粗提DNA溶液。

5.如權利要求4所述的高效提取用于PCR擴增的地下水微生物DNA的方法，其特征在于，第四步中所述純化微生物基因組DNA的操作過程為：

①向粗提DNA溶液加入與粗提DNA溶液等體積的一號抽提液抽提10min后，于冰上靜置15～20min；再于4℃溫度下12000r/min離心10min后，取上清液至新離心管得到二號上清液；

②向二號上清液中加入與二號上清液等體積的二號抽提液，抽提10min后于冰上靜置15～20min，再于4℃溫度下12000r/min離心10min，取上清，得到三號上清液；

③向三號上清液中加入三號上清液2倍體積的預冷無水乙醇，于-20℃溫度下沉淀30～60min，再于12000r/min轉速下離心15min，去除上清液得到二號沉淀；

④向二號沉淀中加入體積濃度為70%的預冷乙醇清洗二號沉淀兩次，將沉淀自然風干后，再加入50μl含有微量核糖核酸酶的TE緩沖液，得到純化的微生物基因組DNA，于-20℃溫度下保存備用。

6.如權利要求5所述的高效提取用于PCR擴增的地下水微生物DNA的方法，提取緩沖液的成分為：50～l00mmol/L的三羥甲基氨基甲烷和鹽酸、l00～300mmol/L的乙二胺四乙酸、質量分數為5%～10%的十六烷基三甲基溴化銨、濃度為0.5～1mol/L的蔗糖，pH值為8.0。

7.如權利要求6所述的高效提取用于PCR擴增的地下水微生物DNA的方法，其特征在于，第一步中所述收集地下水微生物的操作中，地下水樣品取用10～50L，無菌微孔濾膜的孔徑為0.22μm。