[發明專利]一種γ-氨基丁酸快速檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201310287428.4
• 申請日: 2013-07-10
• 公開（公告）號: CN103487389A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 姜毓君;滿朝新;閆天文
• 申請（專利權）人: 黑龍江省乳品工業技術開發中心
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種γ-氨基丁酸快速檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

GABA為γ-氨基丁酸，又稱氨酪酸，是一種非蛋白質天然氨基酸，是中樞神經系統中重要的抑制性神經遞質，具有很重要的生理功能，并廣泛應用于食品中。近年來，GABA在食品中的應用研究正在掀起，而食品中GABA快速測定方法的報道尚不多見。關于GABA的測定近年來國內外有氨基酸分析儀測定、酶法、色質聯用法、柱層析熒光測定法、紙電泳比色、毛細管氣相色譜法、放射性受體法、毛細管電泳法，以及高效液相色譜法等，這些方法大多用于醫學領域，價格昂貴，而且費時，不適用于大量的定量分析。在進行高產GABA乳酸菌株的篩選中，以及菌株發酵條件優化中，都要進行大量的GABA定量分析。顯然需要一種簡便、價廉的定量測定方法，因此本文研究了利用雙酶試劑盒快速定量測定GABA的方法。

發明內容

本發明提供了一種γ-氨基丁酸快速檢測試劑盒，技術方案如下：

每200μL反應體系含有：25-40μg?GABase、2-3mM?NADP+、5-15mM二硫蘇糖醇、1-4mMα-酮戊二酸、500-800mM硫酸鈉、70-100mM?Tris-Hcl。

優選地，每200μL反應體系組成如下：Tris-Hcl：80mM、NADP⁺：1.4mM、二硫蘇糖醇：10mM、α-酮戊二酸：2.0mM、硫酸鈉：750mM、GABase：30μg。

本發明還提供了一種γ-氨基丁酸快速檢測方法，步驟如下：

1）每200μL反應體系含有：25-40μg?GABase、2-3mM?NADP+、5-15mM二硫蘇糖醇、1-4mMα-酮戊二酸、500-800mM硫酸鈉、70-100mM?Tris-Hcl；

2）將預處理后的樣品加入上述反應體系反應，在波長340nm檢測吸光度；

3）將配置好的不同濃度梯度的GABA標準樣品添加到反應體系中，建立標準曲線，未知樣品中GABA含量的根據標準曲線計算得到。

GABase或GABA酶均為γ-氨基丁酸轉氨酶。

具體而言，檢測GABA含量的方法按以下步驟實現：

1）200μL反應體系：

Tris-Hcl：80mM

NADP⁺：1.4mM

二硫蘇糖醇：10mM

α-酮戊二酸：2.0mM

硫酸鈉：750mM

GABase：30μg

樣品溶液：20μL

2）將預處理后的樣品加入上述反應體系反應，反應溫度為30℃，在波長340nm檢測吸光度；

3）將配置好的不同濃度梯度的GABA標準樣品添加到反應體系中，建立標準曲線，未知樣品中GABA含量的根據標準曲線計算得到。

對于發酵酸奶樣品中γ-氨基丁酸的檢測，需要將發酵酸奶樣品進行前處理，避免酸奶中蛋白質、氨基酸等物質對于γ-氨基丁酸測定產生影響。具體預處理方法如下：取50g乳酸菌發酵奶，10000rpm離心20min，取40mL上清液加入10mL10％的磺基水楊酸，0.45um濾膜過濾，4℃冷藏靜置60min，14500rpm離心15min，0.45um濾膜過濾，使用旋轉蒸發儀對樣品濃縮，濃縮液置于4℃備用。

本發明提供的檢測方法，準確率高、檢測速度快，整個檢測結果可以在30min以內完成，有利于提高食品檢驗檢疫機構的檢測能力。

具體實施方式

實施例1快速檢測反應體系的建立

反應體系包括的化學試劑為γ-氨基丁酸轉氨酶、琥珀酸半醛脫氫酶、輔酶II、二硫蘇糖醇、α-酮戊二酸、硫酸鈉、Tris-Hc。其中每200uL反應體系含有25ug?GABase、2mM?NADP+、15mM二硫蘇糖醇、1mMα-酮戊二酸、500mM硫酸鈉、70mM?Tris-Hcl。

將樣品20μL加入上述反應體系中進行反應；上述反應體系可檢出最低GABA濃度為0.5mM，低于0.5mM檢測會受到限制。

實施例2快速檢測反應體系的建立

反應體系包括的化學試劑為γ-氨基丁酸轉氨酶、琥珀酸半醛脫氫酶、輔酶II、二硫蘇糖醇、α-酮戊二酸、硫酸鈉、Tris-Hc。其中每200uL反應體系含有30ug?GABase、3mM?NADP+、10mM二硫蘇糖醇、2mMα-酮戊二酸、750mM硫酸鈉、80mM?Tris-Hcl。