[發明專利]一種快速檢測乳中阪崎腸桿菌的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201310287426.5
• 申請日: 2013-07-10
• 公開（公告）號: CN103484536A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 姜毓君;滿朝新;董鑫悅
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12R1/01
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種快速檢測乳中阪崎腸桿菌的試劑盒及其應用，屬于食品安全技術領域。

背景技術

阪崎腸桿菌（Enterobacter?sakazakii）是一種革蘭氏陰性、無芽孢的兼性厭氧細菌。它能導致任何年齡層人群的疾病，尤其是對早產兒、出生體重輕的嬰兒或免疫受損嬰兒的威脅最大，能引起新生兒敗血癥、腦膜炎和壞死性小腸結腸炎。因此，阪崎腸桿菌是許多國家食品中微生物的必檢指標之一。然而，傳統的檢測方法操作復雜、耗時長以及需要復雜昂貴的儀器。環介導等溫擴增技術由Notomi等于2000年建立，該技術針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用具有鏈置換活性的Bst?DNA聚合酶，在恒溫條件下（60-65℃）高效（0.5-1.0h）擴增目標DNA，具有很高的特異性和靈敏度。然而，傳統的電泳檢測方法費時費力、染料和濁度檢測方法易受肉眼觀察誤差，均不適宜現場檢測。本方法所采用的試紙條技術快速靈敏且結果判讀容易，適用于現場檢測。

發明內容

本發明提供了一種快速檢測乳中阪崎腸桿菌的試劑盒。

所述試劑盒組成如下：所述試劑盒由LAMP擴增反應體系，Bst?DNA聚合酶，探針和膠體金試紙條組成；所述探針帶有抗原物質用于標記LAMP擴增產物；所述試紙條上設有檢測線和控制線，檢測線上埋有抗體，與抗原物質標記的LAMP擴增產物結合顯色；所述LAMP擴增反應體系由LAMP引物組和擴增反應液組成；所述擴增反應液含有0.4～2.4mmol/L?dNTP、甜菜堿和2mmol/L～6mmol/L?MgCl₂，Bst?DNA聚合酶相對于50μL的PCR反應體系添加范圍為4U～8U。

本發明中采用生物素及其抗體作為顯色反應的成分，根據本發明原理，采用其他抗原或抗體均可達到本發明的技術效果。

所述LAMP引物組從以下四組中任選其一：1）SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.6；2）SEQ?ID?NO.7-SEQ?ID?NO.12；3）SEQ?ID?NO.13-SEQ?ID?NO.18；4）SEQ?ID?NO.19-SEQ?ID?NO.24。

LAMP引物組中外引物、內引物、環引物比例關系可以經過有限次實驗確定，實驗發現外引物與內引物比例為1:4～1:9，外引物與環引物比例為1:1～1:5時擴增效果較好。

所述探針上攜帶抗原，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.25－SEQ?ID?NO.28所示，根據LAMP引物組核苷酸序列，根據擴增得到的LAMP產物，可以設計出多種探針。

PCR擴增反應液含有dNTP、甜菜堿和MgCl₂，其作用為輔助LAMP引物組PCR擴增阪崎腸桿菌DNA特異性序列,所述dNTP濃度優選0.4～2.4mmol/L，MgCl₂優選2mmol/L～6mmol/L。

所述Bst?DNA聚合酶相對于50μLPCR反應體系添加范圍為4U～8U。

本發明還提供了一種應用上述試劑盒快速檢測乳中阪崎腸桿菌的方法。

為解決上述技術問題，提供技術方案如下:提取受檢乳的DNA，以提取物作為模板進行LAMP擴增，得到LAMP擴增產物，用試紙條鑒定擴增產物。

所述試劑盒應用的具體步驟為：

第一步：受檢乳樣的DNA提取；向受檢乳中加入DNA提取液、蛋白酶K、溶菌酶、溶壁酶孵育；再向其中加入SDS后加入等體積的氯仿離心后取上清；在取得的上清中加入預冷的異丙醇顛倒混勻；將其轉移到吸附柱AC中離心后加入漂洗液漂洗；加入洗脫緩沖液孵育后離心；將得到的溶液重新加入離心吸附柱中離心后得到的液體即為乳中DNA。

第二步：以提取物作為模板進行LAMP擴增，得到LAMP擴增產物，LAMP擴增條件為：90℃～99℃PCR反應5～10min，迅速置于0～4℃加入Bst酶，60～65℃酶促反應40～90min，升溫至80～100℃使酶鈍化2～10min。

第三步：擴增產物的試紙條鑒定；將探針與擴增產物雜交，在60～65℃雜交2-10分鐘然后將雜交產物與緩沖液孵育，最后將試紙條放入，觀察試紙條檢測線是否有條帶進行結果判讀。

本實施方法對儀器設備要求簡單，只需水浴條件即可完成，耗時較短，約2小時即可完成，檢測靈敏度高。本發明制備的膠體金試紙條技術能夠簡化電泳方法的復雜儀器且大大縮短了反應時間。相較于濁度法和染料法，則沒有肉眼觀測的誤差。更適宜現場檢測。本發明為乳中阪崎腸桿菌的現場檢測開辟了新思路。用此方法在阪崎腸桿菌樣品不合格產品中同樣檢出阪崎腸桿菌。