[發(fā)明專利]一種快速檢測(cè)乳中阪崎腸桿菌的試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310287426.5
• 申請(qǐng)日: 2013-07-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103484536A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜毓君;滿朝新;董鑫悅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/10;C12R1/01
• 代理公司: 北京愛(ài)普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種快速檢測(cè)乳中阪崎腸桿菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系，Bst?DNA聚合酶，探針和膠體金試紙條組成；所述探針帶有抗原物質(zhì)用于標(biāo)記LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物；所述試紙條上設(shè)有檢測(cè)線和控制線，檢測(cè)線上埋有抗體，與抗原物質(zhì)標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合顯色；所述LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系由LAMP引物組和擴(kuò)增反應(yīng)液組成；所述擴(kuò)增反應(yīng)液含有0.4～2.4mmol/L?dNTP、甜菜堿和2mmol/L～6mmol/L?MgCl₂，Bst?DNA聚合酶相對(duì)于50μL的PCR反應(yīng)體系添加范圍為4U～8U。

2.如權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，LAMP引物組從以下四組中任選其一：1）SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.6；2）SEQ?ID?NO.7-SEQ?ID?NO.12；3）SEQ?ID?NO.13-SEQ?ID?NO.18；4）SEQ?ID?NO.19-SEQ?ID?NO.24。

3.如權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述LAMP引物組為SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.6，所述探針核苷酸序列為SEQ?ID?NO.25。

4.如權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述LAMP引物組為SEQ?ID?NO.7-SEQ?ID?NO.12，所述探針核苷酸序列為SEQ?ID?NO.26。

5.如權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述LAMP引物組為SEQ?ID?NO.13-SEQ?ID?NO.18，所述探針核苷酸序列為SEQ?ID?NO.27。

6.如權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述LAMP引物組為SEQ?ID?NO.19-SEQ?ID?NO.24，所述探針核苷酸序列為SEQ?ID?NO.28。

7.如權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系組成如下：

反應(yīng)體系為50μL反應(yīng)體系。

8.權(quán)利要求1所述試劑盒在乳中阪崎腸桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用。

9.如權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，具體步驟如下：

1）受檢乳樣的DNA提??；向受檢乳中加入DNA提取液、蛋白酶K、溶菌酶、溶壁酶孵育；再向其中加入SDS后加入等體積的氯仿離心后取上清；在取得的上清中加入預(yù)冷的異丙醇顛倒混勻；將其轉(zhuǎn)移到吸附柱AC中離心后加入漂洗液漂洗；加入洗脫緩沖液孵育后離心；將得到的溶液重新加入離心吸附柱中離心后得到的液體即為乳中DNA；

2）以提取物作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，得到LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，LAMP擴(kuò)增條件為：90℃～99℃PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）反應(yīng)5～10min，迅速置于0～4℃加入Bst酶，60～65℃酶促反應(yīng)40～90min，升溫至80～100℃使酶鈍化2～10min；

3）擴(kuò)增產(chǎn)物的試紙條鑒定；將探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，在60～65℃雜交2-10分鐘然后將雜交產(chǎn)物與緩沖液孵育，最后將試紙條放入，觀察試紙條檢測(cè)線是否有條帶進(jìn)行結(jié)果判讀。