[發明專利]一種轉座因子載體及其轉基因后代的篩選方法

無效

• 申請號: 201310286311.4
• 申請日: 2013-07-09
• 公開（公告）號: CN103352049A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發明（設計）人: 瞿紹洪;趙建華;李軍;周潔;汪得凱;陶躍之
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司 33101
• 代理人: 魯秦

技術領域

本發明涉及一種轉基因研究領域，尤其是一種產生無選擇標記轉基因植物的轉座因子載體及其轉基因后代的篩選方法。

背景技術

DNA載體應用于植物遺傳轉化研究領域時，通常會包含一個能表現抗生素抗性或除草劑抗性的選擇標記基因，以提高轉化細胞的篩選效率。然而，轉基因植株中的標記基因可能會對人體產生毒性或者過敏反應，也可能會造成嚴重的環境災難，這些因素嚴重地限制了轉基因技術在實踐中的應用。因此，近年來，建立高效而可靠的無選擇標記轉基因技術，已成為轉基因育種應用的研究熱點。

作為獲得無選擇標記轉基因植株的一種方法，轉座子技術利用玉米Ac/Ds轉座因子，將目的基因與抗生素抗性選擇標記一起導入植物基因組，通過Ds元件的轉座跳躍使得目的基因與選擇標記發生遺傳重組，從而產生無選擇標記的轉基因后代。轉座子技術相對于其他無選擇標記系統具有兩個主要的優點：第一，通過Ds轉座，可以從少數幾個水稻轉化事件衍生出在不同基因組位點整合和遺傳穩定的轉基因后代，所以該方法僅需要獲得較少數目的T₀轉化植株。第二，帶有目的基因的轉座因子，在植物基因組中穩定轉座后，其插入邊界清楚、轉基因DNA結構變異的頻率較低，有利于目的基因的穩定表達。

最初，Goldsbrough設計的T-DNA轉化載體含有NptII選擇標記基因、無轉座功能的順式Ac轉座酶基因以及嵌合在Ds元件中的GUS報告基因。在轉化番茄之后，Ds/GUS元件轉座到非連鎖的位點，并在轉化體自交之后與NptII發生分離，從而產生了去除NptII或者Ds/GUS的轉基因后代。然而，穩定的Ds插入系的鑒定常常依賴于對大量的轉基因后代進行Southern?blot印記雜交分析，這種方法費力且效率低。而Ac/Ds轉座因子順式激活標簽系統描述了一種高效的負選擇過程，其T-DNA供體位點上的Ds元件與Ac轉座酶基因和GFP標記相連，而GFP被用作負選擇標記，以剔除那些含有T-DNA供體位點的后代；同時，代表轉座事件的植株被嵌合在Ds元件的RFP所選擇。

發明內容

本發明要解決上述現有技術的缺點，提供一種可以從Ac/Ds轉座因子載體的轉基因后代中高效地篩選無選擇標記轉基因個體的方法。

本發明解決其技術問題采用的技術方案：一種產生無選擇標記轉基因植物的轉座因子載體，其特征是：通過以下步驟構建：1）將綠色熒光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性選擇標記基因(HPT)、來源于玉米的Ac轉座酶基因（AcTPase）和Ds轉座因子串聯組裝在一起，構建轉座因子載體pLJ26，其中Ds因子不帶有任何選擇標記，并且預先在其內部設計一個AscI單酶切位點；2）構建一個在多克隆位點兩側均含有AscI酶切位點的中間載體pLJ16，以組裝任意目的基因，然后將目的基因切下并克隆到Ds因子內部。

作為優選，步驟1）具體地說，分別將不能移動的Ac轉座酶基因（AcTPase）、綠色熒光蛋白基因（GFP）、具有轉座能力的Ds因子以及潮霉素磷酸轉移酶基因（HPT）順次組裝為順式Ac/Ds轉座因子載體pLJ26；由于該載體同時含有AcTPase和Ds，所以當T-DNA轉入植物細胞后，便會發生Ds的轉座行為；在Ds內部設有一個稀有的八堿基AscI單酶切位點，以便再導入目的基因；隨著Ds在植物基因組的跳躍，目的基因也會整合到基因組中新的位置；而HPT被用作轉基因的抗性選擇標記。

作為優選，步驟2）具體地說，在克隆中間載體pLJ16的多克隆位點兩側設計AscI雙酶切位點，可以將任意不含該位點的目的基因組裝其內，隨后將目的基因從中間載體釋放出來，導入到與之配套的Ds因子的AscI酶切位點。

一種轉座因子載體的轉基因后代的篩選方法，包含以下步驟：3）在轉化水稻的過程中，GFP用作報告基因正向篩選T₀代被轉化的陽性植物細胞和植株，而在T₁代以及后續分離世代，GFP用作負選擇標記以篩查并淘汰含有T-DNA的GFP陽性植株，從而富集GFP陰性植株中非連鎖的Ds（目的基因）轉座事件；4）將GFP陰性植株的葉片混合成池，提取混池樣品DNA并通過PCR檢測目的基因，然后對陽性混池中的每一個體分別進行目的基因的檢測，由此獲得的陽性植株便是無選擇標記的轉基因個體。