[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)座因子載體及其轉(zhuǎn)基因后代的篩選方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310286311.4
• 申請日: 2013-07-09
• 公開（公告）號: CN103352049A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 瞿紹洪;趙建華;李軍;周潔;汪得凱;陶躍之
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州九洲專利事務(wù)所有限公司 33101
• 代理人: 魯秦

1.一種轉(zhuǎn)座因子載體，其特征是：通過以下步驟構(gòu)建：1）將綠色熒光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性選擇標(biāo)記基因(HPT)、來源于玉米的Ac轉(zhuǎn)座酶基因（AcTPase）和Ds轉(zhuǎn)座因子串聯(lián)組裝在一起，構(gòu)建轉(zhuǎn)座因子載體pLJ26，其中Ds因子不帶有任何選擇標(biāo)記，并且預(yù)先在其內(nèi)部設(shè)計(jì)一個(gè)AscI單酶切位點(diǎn)；2）構(gòu)建一個(gè)在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)均含有AscI酶切位點(diǎn)的中間載體pLJ16，以組裝任意目的基因，然后將目的基因切下并克隆到Ds因子內(nèi)部。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)座因子載體，其特征是：所述步驟1）具體地說，分別將不能移動的Ac轉(zhuǎn)座酶基因（AcTPase）、綠色熒光蛋白基因（GFP）、具有轉(zhuǎn)座能力的Ds因子以及潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPT）順次組裝為順式Ac/Ds轉(zhuǎn)座因子載體pLJ26；在Ds內(nèi)部設(shè)有一個(gè)稀有的八堿基AscI單酶切位點(diǎn)，以便再導(dǎo)入目的基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)座因子載體，其特征是：所述步驟2）具體地說，在克隆中間載體pLJ16的多克隆位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)AscI雙酶切位點(diǎn)，可以將任意不含該位點(diǎn)的目的基因組裝其內(nèi)，隨后將目的基因從中間載體釋放出來，導(dǎo)入到與之配套的Ds因子的AscI酶切位點(diǎn)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)座因子載體轉(zhuǎn)基因后代的篩選方法，包含以下步驟：3）在轉(zhuǎn)化水稻的過程中，GFP用作報(bào)告基因正向篩選T₀代被轉(zhuǎn)化的陽性植物細(xì)胞和植株，而在T₁代以及后續(xù)分離世代，GFP用作負(fù)選擇標(biāo)記以篩查并淘汰含有T-DNA的GFP陽性植株，從而富集GFP陰性植株中非連鎖的Ds（目的基因）轉(zhuǎn)座事件；4）將GFP陰性植株的葉片混合成池，提取混池樣品DNA并通過PCR檢測目的基因，然后對陽性混池中的每一個(gè)體分別進(jìn)行目的基因的檢測，由此獲得的陽性植株便是無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因個(gè)體。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)座因子載體轉(zhuǎn)基因后代的篩選方法，其特征是：所述步驟3）具體地說，在愈傷組織的選擇培養(yǎng)、分化培養(yǎng)乃至陽性T₀植株的篩選等過程中，可以通過臺式熒光檢測器檢測水稻的轉(zhuǎn)化愈傷組織細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植株的綠色熒光，以區(qū)分成功的轉(zhuǎn)化事件和未成功的轉(zhuǎn)化事件；從T₀代陽性植株收獲T₁代種子，在其發(fā)芽之后，按照同樣的方法觀察T₁代幼苗的綠色熒光，以負(fù)向選擇的方式淘汰那些帶有綠色熒光的含有T-DNA的T₁代植株，同時(shí)，那些轉(zhuǎn)座到T-DNA附近的非連鎖轉(zhuǎn)座事件也被剔除；最終，將非連鎖的Ds（目的基因）轉(zhuǎn)座事件富集到GFP陰性的無選擇標(biāo)記后代當(dāng)中；T₂代乃至更多的分離世代，也可以按照上述方法篩選非連鎖的Ds（目的基因）轉(zhuǎn)座事件。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)座因子載體轉(zhuǎn)基因后代的篩選方法，其特征是：所述步驟4）具體地說，在轉(zhuǎn)基因分離世代，在完成GFP陽性植株的負(fù)選擇之后，將5-8個(gè)GFP陰性植株的葉片等量混合，構(gòu)成混合池，提取混合池樣品DNA，通過PCR檢測目的基因，以篩選帶目的基因的無選擇標(biāo)記混合池；然后對陽性混合池中每一個(gè)體分別進(jìn)行目的基因的檢測，從而獲得帶有目的基因的無選擇標(biāo)記植株。